0 引言

兰香草Caryopteris incana(Thunb.)Miq.是马鞭草科莸属植物^[1]，主要分布在亚洲东部和中部。在我国，广西分布较多。该属植物报道最多的化学成分是黄酮类，已报道的所含化学成分包括黄酮、烷酸、二烯豆甾醇、环烯醚萜、挥发油等^[1]。兰香草作为药材入药，内服可用于治疗风寒感冒、风湿麻痹等症；外敷可用于治疗出血、疮疖肿痛等^[2]。中药质量评价和控制是药材研究的热点之一，以往的评价方法只能针对单一的成分指标，难以反映药材的整体质量，而指纹图谱可以对中药材的多个成分指标作评价，能够全面反映药材的整体质量^[3-11]。目前，对广西产兰香草指纹图谱未见有公开的报道，本文对广西产兰香草进行指纹图谱的研究，建立其高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为科学评价和有效鉴别兰香草提供方法和依据。

1 材料与方法 1.1 材料

仪器：超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公司)；高效液相色谱仪(Alliance e2695, 美国沃特世)。

试剂：乙腈、冰乙酸(色谱纯)；水(超纯水)；其他试剂均为分析纯。芦丁对照品(批号：0787-200102，中国药品生物制品检定所，供含量测定用)。

药材：本实验所用兰香草药材共10批(S1-S10)，经广西一心药业副主任药师马利飞鉴定均为马鞭草科植物兰香草(C.incana(Thunb.)Miq)地上部分，详见表 1。

1.2 实验方法 1.2.1 色谱柱的选择

进行预实验比较不同厂家色谱柱的分离效果。A：菲罗门Phenomenex 00G-4435-E0 C₁₈ (250 mm×4.6 mm，5 μm)；B：安捷伦Agilent Eclipse Plus-C₁₈(250 mm×4.6 mm，5 μm)；C：Wondasil C₁₈-WR (250 mm×4.6 mm，5 μm)。结果表明A色谱柱分离效果最好，在实验过程中A色谱柱能有效地分离主要化合物，并且基线比较平稳，分析时间较短，因此选择A色谱柱作为指纹图谱分析的色谱柱。

1.2.2 流动相系统的选择

从4种流动相系统中筛选适合的搭配：甲醇-水, 甲醇-0.1%冰乙酸, 乙腈-水, 乙腈-0.1%冰乙酸。HPLC图谱的考察结果显示，甲醇-水、甲醇-0.1%冰乙酸系统信息较少，甲醇-水系统整体峰形不均匀，且信息少；甲醇-0.1%冰乙酸系统峰分离度低，整体峰形不均匀，基线不稳；乙腈-水分离度相对于甲醇-水、甲醇-0.1%冰乙酸这两个系统比较好，但峰分布不均匀；乙腈-0.1%冰乙酸系统整体峰形较好，分离度较好，提供信息较多。因此，确定流动相统为乙腈-0.1%冰乙酸。

1.2.3 检测波长的选择

使用2998-DAD检测器对样品进行190~400 nm全波长扫描，获得3D色谱图(图 1)，并重点考查了250 nm、280 nm、300 nm、305 nm、310 nm波长处色谱峰，结果显示，图谱在300 nm处出峰较多，且各色谱峰峰形较好，分离较好，基线较平稳。因此，确定兰香草的检测波长为300 nm。

1.2.4 柱温的选择

分别设定了25℃、30℃不同的柱温进行考察，在其他色谱条件相同情况下，两个柱温的分离效果相差不大，但25℃分离的效果相对较好，基于对色谱柱和仪器的保护，确定柱温为25℃。

1.2.5 流速的选择

分别设定了0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min不同的流速进行考察，在其他色谱条件相同情况下，两个流速的分离效果差别较大，0.8 mL/min分离效果较差，信息量较少，峰形整体分布不均匀，而1.0 mL/min分离效果较好，峰分布较均匀，分离度较高，因此选择流速为1 mL/min。

1.2.6 测定方法的确定

色谱柱为菲罗门Phenomenex 00G-4435-E0 C₁₈(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%冰乙酸进行梯度洗脱，检测波长为300 nm，流速为1 mL/min，柱温为25℃，进样量为10 μL。梯度洗脱时间程序见表 2，理论塔板数大于4 000，离度大于1.5。

1.2.7 延长冲洗时间确定

取一供试品溶液，按1.2.6的条件进样，梯度洗脱170 min。延长冲洗色谱图(图 2)显示，所有组分均在100 min内洗脱出柱，在100 min后已无峰，因此延长冲洗时间确定为100 min。

1.3 方法学考察 1.3.1 考察提取溶剂

考察水、95%乙醇、乙酸乙酯、正丁醇的提取效果。进样2 g，超声提取45 min。结果显示，30 mL 95%乙醇提取效果最好，因此选择95%乙醇作为提取溶剂。

1.3.2 考察提取方法

考察了超声提取和回流提取，结果回流提取供试品溶液色谱图峰较少且峰较弱小，因此选择超声提取方法。

1.3.3 供试品溶液制备

综上预实验结果，确定供试品溶液制备方法：取兰香草药材粉末约2 g，精密称定，置50 mL锤形瓶中，加入30 mL 95%乙醇。超声45 min，放冷，过滤，水浴锅上挥干溶剂，加5 mL甲醇溶解，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.3.4 参照物的选择与配制

指纹图谱的建立必须设置参照峰，根据供试品中所含化学成分的性质，选择芦丁作为参照物，芦丁的色谱图见图 3。参照物溶液配置方法：精密称定芦丁对照品56.66 mg，置于25 mL容量瓶中用甲醇溶剂溶解，定容至标定刻度。

1.3.5 精密度试验

制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6针，记录色谱图，计算兰香草保留时间和峰面积的精密度。结果：保留时间相对标准偏差(Relative standard deviation, RSD)值为0.073%~0.305%，峰面积的RSD值为0.081%~0.782%，精密度符合要求。

1.3.6 重复性试验

制备供试品溶液，在上述色谱条件下连续进样6针，记录色谱图，计算保留时间和峰面积的精密度。结果：保留时间RSD值为0.024%~0.376%，峰面积的RSD值为0.182%~0.714%，重复性符合要求。

1.3.7 稳定性试验

制备供试品溶液，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测图谱，考察样品的稳定性。结果：各色谱峰的相对保留时间RSD值为0.050%~0.560%，相对峰面积的RSD值为0.160%~0.790%，稳定性符合要求。

2 结果与分析 2.1 兰香草的指纹图谱和共有峰

从10个产地来源的药材中各取一批作为样本(S1—S10)，进行色谱测定。结果(图 4)显示，这10批兰香草指纹图谱高度相似。

以1号药材为参照图谱，采用《中国药典》颁布的指纹图谱相似度评价软件，对10批兰香草的HPLC色谱图进行自动匹配，时间窗宽度为0.1 min，以平均数法生成对照指纹图谱(图 5)。由图可见，兰香草指纹图谱共有峰为8个，其中4号峰也是参照物芦丁的参照峰，说明芦丁为兰香草中成分含量比较稳定的成分。设定参照峰的相对保留时间和相对峰面积为1，以此为基准分别计算出10批兰香草的相对保留时间和相对峰面积，结果兰香草相对保留时间RSD值为0.067%~0.833%，相对峰面积RSD值为7.17%~24.50%，指纹图谱共有峰的面积占比为91.38%~94.66%，说明其重现性较好。

2.2 不同药材来源的兰香草指纹图谱比较

以1号样品图谱为参照谱，再自动匹配，以平均数的方式生成共有模式图谱R，进行整体相似度评价。结果表明，广西各产地10批兰香草的相似度，广西中医药大学植物园为0.875~1.000；钦州为0.879~1.000；武鸣为0.866~1.000；防城港为0.876~1.000；上思县为0.866~1.000；浦北县为0.892~1.000；合浦县为0.966~1.000；东兴县为0.865~1.000；广西药用植物园为0.892~1.000，经计算符合中药指纹图谱的规定均大于0.9，说明不同产地来源的兰香草质量相对都比较稳定，HPLC法可适用于兰香草的质量评价和控制。

3 结论

采用色谱法对中药进行指纹图谱研究已有相应报道^[3-11]，本实验对不同来源的10批兰香草进行HPLC色谱分析，获得了兰香草指纹图谱对照指纹图谱。用95%乙醇提取兰香草化学成分，得到的指纹图谱杂质峰相对其他溶剂较少、信号较多，有效成分峰更具有代表性。通过对流动相系统的优化，确定流动相为乙腈-0.1%冰乙酸，此系统梯度洗脱分离效果较好，重现性良好。该洗脱系统参照峰出峰时间比较适宜，作为参照物进行相对保留时间和峰面积计算，符合指纹图谱研究要求。从实验的数据分析可看出，各批次的共有峰的相对保留时间与相对峰面积都非常接近。从相似度可看出，10批兰香草的相似度都大于0.9，符合中药指纹图谱的规定，说明兰香草质量比较稳定，可用于兰香草的内在质量控制。