0 引言

厚藤(Ipomoea pes-caprae (Linn.) Sweet)，又名二叶红薯、马鞍藤，为旋花科番薯属草本植物，是我国南方沿海的民间常用海洋中药，中医认为其味辛、苦，性微寒，归肺、肝、胃、大肠经，具祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效^[1-2]。现代研究表明，其活性成分酚酸类、黄酮类具有抗胶原酶、抗氧化等显著药理活性，在食品添加剂及药品食品领域具有很大的开发前景^[3-5]。鉴于厚藤化学成分复杂^[6]、不同产地成分含量差异大，制订厚藤药材的质量标准以评判其优劣，具有重大意义。迄今为止，国内外文献聚焦于厚藤的化学成分、药理活性等领域的探索，未见其质量标准的相关报道。本研究通过对厚藤所含主要药效成分的定性定量分析，建立其质量标准。采用薄层色谱法对厚藤进行薄层鉴别；采用HPLC色谱法，通过波长切换方式完成绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等6个成分的含量测定。

1 材料与方法 1.1 仪器与试药

Waters HPLC高效液相色谱仪，包括四元超高压溶剂系统、自动进样样本管理器、PDA检测器、Empower 2色谱工作站(Waters公司)；十万分之一电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司，型号：SQP)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司，型号：SB25-12D)；电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器有限公司，型号：DZKW-D-6)；双槽展开缸(型号：200 mm×100 mm)；点样毛细管(泰州市兆华贸易有限公司，型号：0.3 mm×100 mm)；硅胶G薄层板(青岛海洋化工集团)。

药品：绿原酸(批号：20170903)、咖啡酸(批号：20171224)、异槲皮苷(批号：20180105)、异绿原酸B(批号：20171029)、异绿原酸A(批号：20170913)、异绿原酸C(批号：20171106)，含量≥98%，均购自于上海融禾医药科技发展有限公司；铁氰化钾(成都金山化学试剂有限公司，批号：20160110)；六水三氯化铁(成都金山化学试剂有限公司，批号：20160316)，香草醛(天津市大茂化学试剂厂，批号：20160711)。

试剂：甲醇、95%乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯等(成都市科龙化工试剂厂，均为分析纯)；石油醚(60~90℃，成都市科龙化工试剂厂)，分析纯；乙腈、甲醇(色谱纯，美国飞世尔试剂公司)；磷酸(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)；水为实验室自制超纯水。

药材：厚藤采集于广西及海南，总计10批(表 1)，经广西中医药大学李永华教授鉴定为旋花科植物厚藤Ipomoea pes-caprae (Linn.) Sweet的干燥茎叶，新鲜药材置烘箱中55℃烘干，粉碎，药材粉末过55目筛备用。

1.2 方法 1.2.1 薄层色谱鉴别 1.2.1.1 供试品溶液的制备

分别称取10个批次厚藤药材粉末各1 g，置具塞锥形瓶中，加入乙酸乙酯10 mL，超声30 min，过滤，将滤液转移至蒸发皿，经60℃水浴浓缩至干，加入1 mL乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液。

1.2.1.2 对照品溶液的配制

精密称取咖啡酸对照品2.211 0 mg，加入甲醇定容于5 mL容量瓶，配制成0.442 2 mg/mL的对照品溶液。

1.2.1.3 供试品溶液提取溶媒的优选

照1.2.1.1节的制备方法，以50%乙酸乙酯、80%乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇为提取溶媒制备供试品溶液，点样于硅胶G薄层板上，在一定温湿度下，以一定比例展开剂预饱和30 min，展开，取出薄层板晾干，浸泡于1%铁氰化钾-2%三氯化铁显色剂中，取出，吹风机吹干，日光下检视。

1.2.1.4 厚藤药材鉴别方法的优化

显色剂的优选：照1.2.1.1节的制备方法，以一定浓度溶媒制备供试品溶液，点样于硅胶G薄层板上，在一定温湿度下，以一定比例展开剂预饱和30 min，展开，取出薄层板晾干，喷显色剂，吹风机吹干，日光下检视。

展开剂的优选：照1.2.1.1节的制备方法，以一定浓度溶媒制备供试品溶液，点样于硅胶G薄层板上，在一定温湿度下，以石油醚:乙酸乙酯:氯仿:甲醇(4:1:1:0.3, V:V:V:V)、正己烷:氯仿:正丁醇(4:1:1, V:V:V)、环己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲酸(6:2:1:0.15, V:V:V:V) 3种展开系统，预饱和30 min，展开，取出薄层板晾干，喷显色剂，吹风机吹干，日光下检视。

不同湿度的优选：照1.2.1.1节的制备方法，以一定浓度溶媒制备供试品溶液，点样于硅胶G薄层板上，在一定温度下，分别在50%、70%的湿度下，以一定比例展开剂预饱和30 min，展开，取出薄层板晾干，喷显色剂，吹风机吹干，日光下检视。

不同温度的优选：照1.2.1.1节的制备方法，以一定浓度溶媒制备供试品溶液，点样于硅胶G薄层板上，在一定湿度下，在10℃、25℃、30℃温度下，以一定比例展开剂预饱和30 min，展开，取出薄层板晾干，喷显色剂，吹风机吹干，日光下检视。

1.2.1.5 厚藤药材的薄层色谱鉴别

照《中国药典》2015年版第四部薄层色谱法(通则0502)，在温度25℃，湿度50%条件下，分别吸取10批厚藤的供试品溶液、对照品咖啡酸溶液各5 μL，依次点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲酸(6:2:1:0.15, V:V:V:V)为展开系统，预饱和30 min，展开，取出晾干后，喷显色剂1%铁氰化钾-2%三氯化铁，快速吹干后，在日光下检视。

1.2.2 厚藤中6个成分的含量测定 1.2.2.1 成分提取

本实验参照笔者的Box-behnken响应面法优化厚藤中6个成分的提取工艺^[7]，采用最佳工艺即乙醇浓度69%，液料比为63 mL/g，提取时间1.5 h，提取厚藤中6个成分，对10批厚藤进行测定。

1.2.2.2 色谱条件

色谱柱：Anglient HC-C18(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；流速：1.0 mL/min；柱温：(30±5)℃；进样量：5 μL；洗脱梯度：0~10 min，7%~8%A；10~30 min，8%~16%A；30~40 min，16%~17%A；40~50 min，17%~19%A；50~65 min，19%~24%A；65~67 min，24%~95%A；67~70 min，95%~95%A。检测波长：0~30 min，λ=325 nm；30~50 min，λ=353 nm；50~70 min，λ=325 nm。

1.2.2.3 溶液的制备

对照品溶液的配制：精密称定适量绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等对照品，分别加入甲醇定容于5 mL容量瓶，配制成一定浓度的混合对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称定10个批次厚藤药材粉末各1 g，置于具塞锥形瓶中，加入69%乙醇63 mL，85℃水浴回流提取3次，每次1.5 h，抽滤，合并滤液，将滤液转移至250 mL旋蒸瓶，旋干，吸取少许提乙醇洗出，转移并定容于25 mL容量瓶，超声30 min，摇匀，吸取2 mL过0.22 μm微孔滤膜，转移至进样瓶备用。

1.2.2.4 线性关系试验

精密移取上述混合对照品溶液，依次稀释一定倍数，配制成一系列不同浓度的混合标准品溶液，注入色谱仪，以6个成分的峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。

1.2.2.5 精密度试验

精密吸取上述混合对照品溶液，连续进样6次，计算6个成分峰面积的RSD值，考察仪器的精密度。

1.2.2.6 重复性试验

称取同一批厚藤药材粉末6份，按照1.2.2.3节方法制备供试品溶液，按相应色谱条件进行分析测定，计算6个成分质量浓度的RSD值，考察该方法的重复性。

1.2.2.7 稳定性试验

取同一厚藤样品溶液，按相应色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h进样，计算6个成分在不同时间点峰面积的RSD值，考察样品的稳定性。

1.2.2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的厚藤药材粉末0.5 ɡ，共计6份，分别加入本品中6个成分质量1倍量的对照品，按照1.2.2.3节制备供试品溶液，按相应色谱条件进行分析测定，计算6个成分的加样回收率。

1.2.2.9 含量测定

照1.2.2.3节供试品制备方法制备供试品溶液，照1.2.2.2节色谱条件进样，分别对10个批次厚藤进行测定，按外标一点法计算绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的含量。

2 结果与分析 2.1 薄层鉴别 2.1.1 供试品溶液提取溶媒的优选

80%乙酸乙酯提取物的TLC色谱图斑点数量多，且与咖啡酸对照品色谱图相同位置呈现蓝色斑点，斑点颜色深且不拖尾(图 1)，所以，选择80%乙酸乙酯作为提取溶媒。

2.1.2 显色剂的优选

咖啡酸在1%铁氰化钾-2%三氯化铁作用下显色灵敏，且厚藤药材TLC色谱图斑点较多(图 2)。所以，选用1%铁氰化钾-2%三氯化铁作为显色剂。

2.1.3 展开剂的选择

由图 3a~c可知，图 3c斑点数量多且清晰，故选用环己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲酸(6:2:1:0.15, V:V:V:V)作为展开剂。

2.1.4 不同湿度的考察

当温度25℃时，50%湿度比70%湿度条件下显色的斑点多且清晰(图 4)。所以选择湿度为50%作为本实验的最佳湿度。

2.1.5 不同温度的考察

由图 5可知，图 5b的TLC色谱图的样品斑点最多，即在相同的点样量条件及相同的展开条件下，温度越低，厚藤的薄层色谱图分离度越好，所以，25℃是最佳环境温度。

2.1.6 厚藤的薄层色谱鉴别

在对照品咖啡酸溶液色谱图相应的水平位置上，10批厚藤供试品溶液均显相同颜色斑点(图 6)，该薄层色谱鉴别法具有较好的适用性，可适用于厚藤药材的鉴别。

2.2 厚藤中6个成分的含量测定 2.2.1 专属性考察

供试品色谱图中绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C等色谱峰与对照品溶液色谱峰的保留时间一致，且与相邻色谱峰的分离度均大于1.5(图 7)。该方法的专属性较好。

2.2.2 线性关系试验

照1.2.2.2节色谱条件，将一系列浓度的混合对照品分别进样，r在0.999 4~0.999 6，回归方程与浓度面积曲线的拟合度较高(表 2)。绿原酸、咖啡酸、异槲皮苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C的浓度与峰面积呈现较好的线性关系。

2.2.3 精密度试验

测定连续进样6次色图谱的峰面积，6个成分色谱峰峰面积的RSD值均小于1%，表明仪器的精密度较好。

2.2.4 重复性试验

测定同一批次6个样品依次进样的色谱图，6个成分质量浓度的RSD值均小于3%，表明该方法的重复性较好。

2.2.5 稳定性试验

测定厚藤在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h不同时间点色谱图，6个成分在不同时间点峰面积的RSD值均小于1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.2.6 加样回收率试验

6个成分的加样回收率在95%~105%内，表明该方法的回收率符合要求。

2.2.7 含量测定

按照上述色谱条件，检测得到10个批次厚藤含量，广西区及海南等地的10批厚藤的质量极不均衡。以活性成分总含量为指标，第2，8，9批的质量较好，第1，5批质量较差(表 3)。

3 结论

本研究建立了海洋中药质量标准中的定性鉴别方法，具有较好的适用性。检测得到厚藤中6个活性成分的含量范围，为厚藤在食药应用方面的质量评价和控制提供科学依据。