0 引言

金花茶(Camellia nitidissima Chi)为山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)金花茶组植物(Camellia Section Chrysantha Chang)，味微苦、涩，性平，具有清热解毒、利尿消肿之功效，主治痢疾、疮疡等^[1]，主要分布于我国广西防城港地区^[2]。现代研究表明，金花茶含有多种多酚类、黄酮类、皂苷类及其他对人体有益的活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、调节代谢等药理作用^[3]。目前，对于金花茶指纹图谱研究有部分关于黄酮类物质的文献报道，邹登峰等^[4]对金花茶叶中黄酮类成分进行指纹图谱研究，以芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈素为参照物，确定了15个共有峰。杨立芳等^[5]采用微波法对金花茶茶花水提液进行有效成分提取，建立了金花茶茶花HPLC特征指纹图谱共有模式，以芦丁为参照物，标示了34个共有峰。而关于金花茶其他成分指纹图谱的研究还鲜有报道。本研究针对金花茶叶中多酚类化合物，建立不同产地金花茶叶HPLC指纹图谱，利用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)技术对部分共有峰进行结构推测。同时运用聚类分析及主成分分析两种方法，分析金花茶叶药材化学成分种类及含量的差异，为更全面评价金花茶药材的质量提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

Waters2695型高效液相色谱系统(美国Waters公司)；Waters UPLC-QTOF-MS仪(型号XEVO G2-S)；KQ520013型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS205电子分析天平(1/10万天平，瑞士梅特勒-托利多公司)；DHG9246A(立式)电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)、RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

所用试剂除甲醇、乙腈为色谱纯外，其余为分析纯。对照品3, 4-o, o-次甲基-鞣花酸-4′-葡萄糖苷(okicamelliaside)由广西中医药研究院重点实验室提供，经UV、IR、1HNMR、13CNMR、MS波谱鉴定结构，经HPLC进样进行峰面积归一化法检测，纯度在98%以上。

10批不同产地金花茶叶均由广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定，金花茶叶来源信息及采集时间见表 1。

1.2 方法 1.2.1 色谱条件

采用Agilent ZORBAX C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱，其中流动相A的比例变化为0—5 min，4%；5—47 min，4%~18%；47—65 min，18%~30%；65—75 min，30%~40%；75—90 min，40%~70%；90—91 min，70%~4%；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：10 μL，记录时间90 min。

1.2.2 质谱色谱条件

色谱柱：Acquity HSS T3 C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，其中流动相A的比例变化为0.0—6.0 min，4%~18%；6.0—10.8 min，18%~30%；10.8—13.0 min，30%~40%；13.0—15.0 min，40%~70%；15.0—15.1 min，70%~4%；15.1—18.0 min，4%；流速：0.5 mL/min；柱温：30℃，分析时间为18 min，样品用0.22 μm滤膜过滤。进样量0.8 μL，采用自动进样方式。

质谱参数：电喷雾电离离子源(ESI)，负离子模检测，质量扫描范围m/z 100~1 500 Da，毛细管电压2.8 kV，锥孔电压40 V，离子源温度100℃，脱溶剂温度350℃，脱溶剂气体流速700 L/h，在线校准物质为亮氨酸脑啡肽，低能量碰撞能6 V，高能量碰撞能35~50 V。

1.2.3 溶液制备

(1) 对照品溶液的制备

精密称取okicamelliaside对照品适量，加甲醇溶液制成每1 mL含okicamelliaside 2.621 mg的对照品溶液。

(2) 供试品溶液的制备

将金花茶叶置于电热恒温鼓风干燥箱中65℃干燥，粉碎机粉碎后过40目筛备用。取金花茶叶粗粉0.5 g，精密称定，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入50%乙醇-0.1 mol/min盐酸(1:1)溶液35 mL，密塞，超声提取90 min，抽滤，减压浓缩至干，甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

1.2.4 方法学考察

取金花茶叶(广西防城区，2016-06)，按1.2.3节方法制备供试品溶液，按“1.2.1”项色谱条件：(1)连续进样6次，记录色谱图，考察仪器的精密度情况；(2)进样分析，记录色谱图，考察该方法的重复性情况；(3)分别于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h进样10 μL，记录色谱图，考察该供试品溶液在24 h内的稳定性情况。

1.2.5 指纹图谱的建立及相似度分析

取10批金花茶叶(S1~S10)，按1.2.3节的方法制备供试品溶液，按1.2.1节色谱条件进行测定，得到10批金花茶的指纹图谱；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版)”对10批样品进行谱图处理分析，采用平均数相关系数法，时间窗宽度为0.2 min，经多点校正和数据匹配生成金花茶的色谱指纹共有模式。

1.2.6 指纹图谱主要成分初步推断

为了得到更加丰富的共有峰成分信息，采用Waters UPLC-QTOF-MS仪对金花茶指纹图谱中共有峰化学成分进行分析鉴定。应用MassLynx 4.1软件对上述色谱峰进行成分推测，联合元素组成、质谱裂解途径分析并参考相关文献做进一步鉴定。

1.2.7 金花茶药材指纹图谱聚类分析及主成分分析

以10批样品的10个明显的共有色谱峰面积为指标，运用SPSS 22.0统计分析软件，进行聚类分析，采用Ward法，平方Euclidean距离度量标准进行聚类分析。应用SPSS统计分析软件对10批金花茶药材进行了主成分分析。

2 结果与分析 2.1 方法学考察结果 2.1.1 精密度考察

测试结果显示，共有峰相对保留时间的RSD＜0.29%，相对峰面积的RSD＜1.80%，小于指纹图谱规定的1%和3%，说明该仪器的精密度符合分析方法的要求。

2.1.2 重复性考察

测试结果显示，主要色谱峰相对保留时间的RSD为＜0.52%，相对峰面积的RSD为＜2.50%，小于指纹图谱规定的1%和3%，说明该方法重复性良好。

2.1.3 稳定性考察

测试结果显示，主要色谱峰相对保留时间的RSD为＜0.46%，相对峰面积的RSD为＜1.62%，各指标RSD均小于指纹图谱规定的1%和3%，表明该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2 指纹图谱的建立及相似度分析

如图 1和图 2所示，10批金花茶叶共标定共有峰10个，其中，7号色谱峰(Okicamellia)与相邻峰分离度最好，分离度＞1.5。10批金花茶叶中，Okicamellia含量均最高，稳定性好且保留时间居中，因此将其定为参照峰。将S1号样品色谱图设为参照图谱，经相似度计算，10批样品相似度为0.905~0.995。共有峰相对保留时间及相对标准偏差、共有峰相对峰面积及相对标准偏差分别详见表 2和表 3。

2.3 指纹图谱主要成分初步推断

初步鉴定了5个色谱峰，通过与对照品保留时间、特征离子等相关信息比对可确认5号峰为3′-甲基鞣花酸-4′-葡萄糖苷、6号峰为鞣花酸、7号峰为okicamelliaside、8号峰为3′-甲基鞣花酸、10号峰为3, 4-o, o-次甲基鞣花酸(表 4~5)。

2.4 金花茶药材指纹图谱聚类分析

从图 3可以看出，10批样品可以分为4类:S3、S4、S7为一类，S6为一类，S7为一类，S1、S2、S5、S9、S10号样品为一类。原因可能是不同产地与不同月份采摘药材的差异。

2.5 金花茶药材指纹图谱主成分分析

由表 6分析结果可知，前5个成分累积贡献率可达97.90%，其中前3个成分贡献较大。将提取的10个成分和对应的特征值做散点图(图 4)，观察散点图发现前3个成分的斜率非常陡，第4，5个成分的斜率较缓，而剩余的其他成分之间的斜率则非常平缓。斜率越陡贡献率越大，主要是前3个成分贡献。

通过SPSS统计分析软件计算出因子负荷矩阵，见表 7，可以看出1，5，6，7，8，10号色谱峰在主成分1中有明显的正相负荷，表明其增加，第一主成分增大；4号色谱峰在第一主成分中有明显的逆相负荷，表明其增加，第一主成分减少；其他的色谱峰对第一主成分影响相对较小。2，3，4，6，9号色谱峰在主成分2中有明显的正相负荷，表明其增加，第二主成分增大；5，7号色谱峰在第二主成分中有明显的逆相负荷，表明其增加，第二主成分减少；其他的色谱峰对第二主成分影响相对较小。对数据矩阵进行PCA后，以第一、二主成分(贡献值较大成分)建立坐标系即将得所有样本的PCA平面得分图见图 5。

3 结论

本研究通过对10批金花茶叶进行指纹图谱分析，共标识出10个共有指纹峰，10批样品的相似度均大于0.900，说明不同产地金花茶叶的化学组成一致性较好。在建立指纹图谱的基础上，采用UPLC-QTOF-MS技术分析金花茶叶中共有成分，鉴定出其中5个多酚类成分。本实验采用指纹图谱对金花茶叶质量进行控制，通过考察，该方法简便且专属性强，所建立的指纹图谱具有较好的稳定性，对进一步研究其药效物质基础有重要意义。