0 引言

细胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一类依赖于亚铁血红素，催化多种复杂氧化反应的多功能酶。它可以催化的底物多种多样，广泛存在于各种生物体内，包括细菌、真菌、哺乳动物以及人体。由于在催化过程中，其和亚铁血红素相互结合，形成硫醇-亚铁-一氧化碳复合物，该复合物在450 nm处具有最大特征吸收波谱，得名P450^[1]。P450酶不但在有害异物的脱毒、类固醇的生物合成以及人体的药物代谢中起非常重要的作用^[2]，而且在天然产物的生物合成中也起到非常关键的作用^[2-3]。

在合成生物学蓬勃发展的今天，人们尝试用各种简单的生物体系去廉价地生产植物来源的结构复杂、活性优良的天然产物分子。在这些分子中，往往存在一个或者多个P450酶，这些酶对天然产物骨架起到后修饰作用，或者是直接增强天然产物的活性，或者是改变天然产物的构型和构象，为下一步的反应做准备。而且，这样的后修饰作用往往是一个限速步骤，对最终产量起到决定作用^[4-5]。除了细菌来源的P450酶，真菌和植物来源的P450酶更加复杂，如何解决这些P450酶的异源表达是一个棘手的问题。甚至有时连起催化功能的P450酶都没有报道，要通过其他替代的P450酶来实现这样的功能转化。

近年，化学研究人员参与到P450酶的研究中成为一个趋势。从化学的角度研究P450酶，结合有机化学和金属化学的知识，使P450酶的研究取得了全新的结果。在这方面，美国加州理工大学的Frences H.Arnold教授做了很多具有突破性的工作。另外，在化学合成中，碳氢活化反应是将氧原子插入到不活泼的碳氢键上，是反应最困难和研究最热门的反应之一，这类反应也可以由P450催化完成^[6-8]。这些工作都使得P450酶成为目前在酶工程以及有机化学中，研究最为广泛的酶之一。本文就P450酶的生物转化和新催化反应这两个方面的最新进展进行了综述。

1 P450酶的生物转化 1.1 有效的电子传递体系

P450酶的催化体系是除了自身以外，还需要铁氧化还原蛋白来维持电子传递的循环。有效的铁氧化还原蛋白对产物的产率影响显著。在抗癌药物埃博霉素的合成中，EpoK是负责埃博霉素生物合成中最后一步环氧化的P450酶。Kern课题组通过筛选自然或者异源的铁氧化还原蛋白体系，得到了P450酶的高效转化，该体系被证明在其他P450酶中也同样使用。进一步通过对11个不同铁氧化还原体系的测试，发现电子传递体系的不同还会导致最终产物的不同^[9-10]。

1.2 de novo设计的P450酶的生物转化

很多天然产物是来自于植物的，这些天然产物含量稀少，价格昂贵。如何把这些分子在简单的细菌或者酵母中进行廉价生产，一直是合成生物学家的研究目标。但植物复杂的基因合成机制，使得这些植物来源的P450酶的发现十分困难。DeLoache课题组报道了利用酿酒酵母生产一种生物碱的中间体S-reticuline。为了提高第一个中间体的产量，利用荧光生物感应器的原理，得到了来自于甜菜的CYP76AD1完成了色氨酸的羟化作用^[11]。另外，Trenchard课题组也成功获得了一个制备S-reticuline的代替途径^[12]。

1.3 植物来源P450酶的生物转化

不同于细菌可溶性的P450酶，植物的P450酶往往结合在细胞的内质网膜上。这使得异源重构变得更加困难。由于大肠杆菌缺少内膜系统，人们的研究较多地集中在酿酒酵母中。Galanie课题组构建了一个从norlaudanosoline到berberine的代谢途径^[13]；而Trenchard课题组也利用多个P450酶构建了一个从norlaudanosoline到sanguinarine的代谢途径^[14]。

除了酿酒酵母，大肠杆菌体系也有成功的例子。Ajikumar课题组利用紫杉醇代谢中的第一个P450酶在高产taxadiene的大肠杆菌中表达，可以得到570 mg/L氧化的紫杉烷^[15]。

2 P450酶的新催化反应 2.1 P450酶利用卡宾开发的新催化反应

在过渡金属催化中，常常用到卡宾试剂作为介导，完成碳碳双键和碳氢键的功能化。在自然界的反应中，之前是没有的，最早的工作是由Arnold课题组在2013年完成的，在这个反应中，重氮盐乙基重氮基醋酸酯作为卡宾，将卡宾试剂替代氧气完成反应，催化烯烃的环丙烷化^[16]。这个工作是将有机化学的方法应用到生物催化中。随后，P450酶的卡宾化学也完成了环丙烷化反应的拓展，在含有该基团的活性天然产物的不对称合成中得到了大量的应用，例如Ticagrelor和Tranylcypromine等^[17-18]。

2016年，一个基于卡宾的新的应用完成，就是利用P450完成了碳硅键的合成，这是第一个酶法催化形成的有机硅。Arnold课题组利用P450酶和卡宾试剂介导的反应，酶法合成具有立体选择性的产物，通过定向进化后活力提高15倍^[19]。

2017年，Arnord课题组又利用P450酶和卡宾系统介导的反应，开发出碳硼键的合成。该反应仍然具有良好的立体选择性。通过定向进化，酶活力比天然状态提高了400倍左右^[20]。

2.2 P450酶利用氮宾开发的新催化反应

磺胺类化合物是典型的氮宾试剂，作为第一个P450酶氮宾的供体得到了应用。利用分子内的碳氢插入完成手性原子的胺化反应。Singh等^[21]将Carbonazidates作为氮宾的供体，合成手性的恶唑烷酮类化合物。随后，还开发了一系列的相关反应。

2.3 P450酶新催化的反马式反应

反马氏反应是有机合成中非常有用的一个反应，而在生物体的反应中，是很少见到的。Arnold课题组利用以一个具有马氏和反马氏混合反应的P450酶进行定向进化的手段，筛选出一个适合反马氏反应的酶^[22]，该酶利用氧气就可以完成该反应。

3 P450酶的工程化 3.1 P450酶与配体结合方式的分子改造

亚铁血红素是P450酶催化的辅助因子，在催化过程中起到重要作用。将P450 BM3的Cys突变为Ser可以稳定二价铁，降低氧气的活化，导致环丙烷化活力增强^[23]。接下来的研究表明His和Ser分别对环丙烷化和氨基化反应是有利的^[24]。来自于硫化叶菌的、热稳定的P450 CYP119，是第一个获得晶体结构的、以组氨酸连接heme的P450酶，它的结构发生了较大的变化。而且，它和heme可以以任意氨基酸连接^[25]。

3.2 P450酶利用不同过渡金属配体的新催化反应

通过不引入铁元素的原卟啉配体，可以引入不同的金属元素到P450的反应中去，就是所谓的“换心”，从而实现铁元素无法完成的新的过渡金属化学反应^[26]。另外，hartwig课题组发展出利用过渡金属铱和卟啉配体为辅因子的P450酶CYP119，该酶表现出良好的催化特性，可以高效地选择性合成，对映异构性超过98%，整体转化数(Total turnover number, TTN)达到35 000^[27]。

3.3 P450酶的区域选择性的改造

TxtE是第一个报道的能有效催化硝化底物色氨酸的酶，分子改造是改变其底物结合位点，将硝化反应的位点从色氨酸的碳5位变为色氨酸的碳4位。其单独的晶体结构和含有色氨酸底物复合物的晶体结构已经得到解析，但是由于天然状态下该酶F-G环的不稳定，导致目前还没有搞清楚该环是如何与底物色氨酸相互作用的。借助计算机分子动态模拟软件，使用马尔科夫状态，对F-G环的开环、闭环和过渡态3种状态进行了重构。处于F-G环上的His176对于酶的不同状态起到关键的控制作用^[28]。计算结果显示176位的空间位阻增加了，并导致底物结合位点的偏移。

4 展望

P450酶作为自然界中存在最广泛和催化最多样的酶之一，到目前为止对它的研究还只是一小部分，还有很多相关的研究有待于进一步开展。P450酶作为一个金属蛋白，在催化过程中，可以说借助蛋白为载体，实现了金属催化。而更多化学背景的研究人员开始利用P450酶完成一些新的催化反应，将酶催化和过渡金属催化相结合，让生物学和化学充分融合，相信这个方向还会有更多有意思的研究出现。同时，借助计算机的动态模拟和共结晶的晶体学手段，从分子水平对P450酶的催化机制做进一步解析，相信可以促进P450酶的研究更上一个台阶，为后续的蛋白质改造奠定理论基础。结合定向改造的方法，让这些酶发挥出更大的作用，完成更多特异性的反应。另外，基因组研究的快速发展加速了酶的研究，人们不再单纯地依赖表型或现象去发现酶，全基因组测序技术可以马上发现所有备选的酶，为快速研究酶提供了新的可能。目前，本课题组已围绕部分链霉菌的P450展开结构生物学研究，相关工作会在后续报道。