【研究意义】卵形鲳鲹和石斑鱼肉质细腻，营养丰富，作为名贵的海水养殖鱼类，在活海鲜市场中的经济价值极高。目前国内石斑鱼养殖年产量已达10万吨以上，卵形鲳鲹年产量则达到8万吨左右，产业直接产值超过200亿元^[1-2]。近年来随着卵形鲳鲹和石斑鱼需求量的不断增加，广西地区的卵形鲳鲹和石斑鱼养殖进入了快速发展期，养殖效益极为显著，市场潜力巨大，有望成为继罗非鱼和对虾养殖后广西的又一大支柱性产业^[3-6]。然而在高密度、集约化网箱养殖条件下，各种病害频繁暴发，造成巨大经济损失^[7]。【前人研究进展】作为包括广西在内的华南沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一，溶藻弧菌引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点，严重威胁华南地区水产养殖业的健康可持续发展^[8-9]。弧菌病的防治一直是研究的重点。目前治疗弧菌病主要是使用抗生素等化学药物，但药物抗菌效果不持久，更严重的是抗生素的滥用不仅加剧了耐药菌株的产生，还造成了水产品中有害药物残留等重大食品安全问题，以及导致近海生态环境不断恶化^[10-11]。【本研究切入点】 2016年春夏交接时期，北海、钦州、防城港等广西卵形鲳鲹主要养殖区暴雨不断，河道暴涨携带大量泥沙进入海水，浑浊的海水不仅造成网箱中卵形鲳鲹产生缺氧应激，更导致鱼病的暴发流行。其中，广西钦州湾近海网箱养殖的卵形鲳鲹发生以体表皮肤溃烂、皮下出血、内脏器官病变为典型症状的细菌性疾病。【拟解决的关键问题】本研究对患病卵形鲳鲹中疑似病原菌进行系统研究，包括对疑似病原菌进行常规形态特征和生理生化反应的生物学检验，通过16S rDNA基因测序对疑似病原菌株进行分子生物学鉴定与系统发育分析，在细胞和鱼体水平开展病原菌的细胞毒性和致病性研究，同时进行人工感染的回接试验，最终证实此次卵形鲳鲹发病的病原菌为弧菌属的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。

卵形鲳鲹头肾组织细胞系(TOHK cell line)保存于本实验室^[12]；0.22 μm滤柱购自Millipore；96孔细胞培养板购自Corning；琼脂平板和细菌生化鉴定管等购自广州环凯微生物有限公司；生化培养箱购自上海博迅，超净工作台为AIRTECH，观察细胞用的倒置光学显微镜为Olympus CX41。

发病的卵形鲳鲹从广西钦州湾近海养殖网箱中采集获得，体长10~15 cm；健康卵形鲳鲹购自钦州的卵形鲳鲹养殖场，体长10~15 cm。在无菌条件下，从患病卵形鲳鲹的肝、脾、肾和体表溃烂组织处取样划线接种于琼脂平板，置于37℃培养24 h后，根据优势菌落的形态大小、颜色特征等进一步纯化培养，纯化后的菌株用30%甘油保存于-80℃超低温冰箱中。

利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取纯化后细菌的基因组DNA，作为PCR反应中的模板DNA。利用16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增，16S rDNA基因通用引物为27F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应程序为98℃预变性5 min，95℃变性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环后72℃延伸10 min。取部分PCR产物进行电泳检测，剩余部分交由上海生物工程服务有限公司测序，并使用NCBI的Blast功能对测序结果进行比对分析。

试验前随机取5尾健康卵形鲳鲹的肝、脾、肾和肌肉组织涂板确定其健康无细菌感染。试验组中，分别将分离得到的疑似病原菌通过腹腔注射接入健康卵形鲳鲹中。对照组1(Con1)中健康卵形鲳鲹腹腔注射无菌PBS，对照组2(Con2)中健康卵形鲳鲹不作任何处理，每组10尾鱼。将分离纯化的菌株在LB液体培养基中37℃培养24 h，然后将菌液用PBS稀释成菌悬液(浓度为1×10⁸ CFU/mL)，试验组的每尾鱼腹腔注射0.2 mL稀释的菌悬液，对照组1注射0.2 mL的PBS，对照组2不作任何处理。各组鱼在28℃继续培养10 d，记录各组鱼的死亡情况，统计10 d内的累计死亡率，同时用LB平板对濒临死亡的卵形鲳鲹肝脏、脾脏、肾脏和肌肉组织进行细菌分离。

将分离纯化的菌株TOQZ01在LB液体培养基中37℃培养36 h，12 000 g 4℃离心30 min后收集上清，使用0.22 μm滤柱过滤上清液后，获得细菌胞外产物(ECPs)，并用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce Biotechnology, Rockford, I L)测定上清液中细菌胞外产物(ECPs)中的蛋白含量。取卵形鲳鲹头肾组织细胞，按照4×10⁴细胞/孔的细胞量接入96孔细胞培养板，28℃培养24 h。该实验分为3组：试验组1(Test 1)，每孔细胞接入10 μL ECPs(300 μg/mL)；试验组2(Test 2)，每孔细胞接入20 μL ECPs(300 μg/mL)；试验组3(Test 3)，每孔细胞接入30 μL ECPs(300 μg/mL)；对照组1(Con 1)，每孔细胞接入10 μL无菌PBS；对照组2(Con 2)，细胞无处理。各组细胞继续培养24 h后在光学显微镜下观察。为了检测ECPs的细胞毒性，即其对细胞活性的影响，各孔中的细胞加入20 μL的WST-8溶液继续在28℃培养4 h，然后用酶标仪检测450 nm处的吸光度，实验分别重复3次。

在无菌操作条件下，从自然发病的卵形鲳鲹肝、脾、肾和体表溃烂组织中分离纯化得到4株优势菌株，标记为TOQZ01, TOQZ02, TOQZ03, TOQZ04。

分离纯化得到的4株菌株在LB平板上37℃培养24 h，生长状况良好，菌落形状为圆形，表面光滑，边缘整齐(图 1a)；4株菌株在TCBS平板上37℃培养24 h后均长成黄色圆形大菌落，表面光滑，边缘整齐(图 1b)。对菌株进行革兰氏染色后镜检发现，该4株菌株均为革兰氏阴性菌(图 1c)。对4株菌株进行生理生化检测，检测结果参照文献报道和常见细菌系统鉴定手册^[13-14]发现，该4株菌株与溶藻弧菌(V.alginolyticus)极为相似(表 1)。

图 1 (Fig. 1)

图 1 疑似病原菌在LB平板(a)和TCBS平板(b)上的菌落形态及革兰氏染色结果(c) Fig.1 The colony morphology and Gram staining results (c) of suspected pathogenic bacteria on LB (a) and TCBS (b) plates

表 1(Table 1)

表 1 株菌株的生理生化检测结果 Table 1 Physiological biochemical test results of 4 strains 生理生化检测项目 Biochemical tests 溶藻弧菌 V.alginolyticus TOQZ01 TOQZ02 TOQZ03 TOQZ04 1%NaCl葡萄糖产气 1%NaCl Glucose - - - - - 1%NaCl葡萄糖磷酸盐胨水 1%NaCl Glucose phosphate peptone water + + + + + 1%NaCl蛋白胨水 1%NaCl Peptone water d + - - + 1%NaCl蔗糖 1%NaCl Sucrose + + + + + 1%NaCl甘露糖 1%NaCl Mannose + + + + + 1%NaCl阿拉伯糖 1%NaCl Arabia sugar - - - - - 1%NaCl肌醇 1%NaCl Inositol - - - - - 1%NaCl赖氨酸脱羧酶 1%NaCl Lysine decarboxylase + + + + + 1%NaCl精氨酸双水解酶 1%NaCl Arginine dihydrolase - - - - - 无盐胨水 Salt free peptone water - - - - - 3%NaCl胨水 3%NaCl Peptone water + + + + + 6% NaCl胨水 6%NaCl Peptone water + + + + + 8% NaCl胨水 8%NaCl Peptone water + + + - + 10% NaCl胨水 10%NaCl Peptone water + - + + - 注：“-”表示阴性，“+”表示阳性; “d”表示结果不定 Notes:“-”indicates negative, “+”indicates positive; “d”indicates indeterminate results

表 1 株菌株的生理生化检测结果 Table 1 Physiological biochemical test results of 4 strains

将4株菌株(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)的16S rDNA经PCR扩增后的产物进行电泳检测，得到预期大小的条带(图 2a)。PCR产物的测序结果显示，条带大小均为1 466 bp。对测序结果进行Blast比对分析，结果显示4株菌株的16S rDNA基因均与溶藻弧菌相似性最高，达到99%。系统进化树结果显示TOQZ01与TOQZ02聚为一族(图 2b)。综合4株菌株的菌落形态特征、菌株生理生化特征和分子生物学鉴定结果，证实这4株菌株均为溶藻弧菌 V.alginolyticus。

图 2 (Fig. 2)

图 2 4株病原菌16S rDNA PCR扩增后的电泳图像(a)和系统进化树(b) Fig.2 Electrophoretic images (a) and phylogenetic tree (b) of four pathogenic bacteria 16S rDNA after PCR amplification

健康卵形鲳鲹在分别注射4株菌株的菌液后的5~8 d内全部死亡(图 3)，并出现与自然发病的卵形鲳鲹相似的皮肤肌肉溃烂、腹鳍出血、内脏器官肿大充血等症状，而两组对照组中，对照组2中的卵形鲳鲹没有死亡或异常，对照组1中的卵形鲳鲹在第1天死亡1尾(可能是由于注射不当致使卵形鲳鲹受伤而死亡)。对病变死亡的卵形鲳鲹的肝、脾、肾和体表溃烂组织处取样，进行细菌学的分离检测和分子生物学鉴定，检出的菌株与4株菌株(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)均具有相似的形态和生理生化特征，且分子生物学鉴定也证明检出的菌株为溶藻弧菌。由此证明，溶藻弧菌是此次广西钦州湾近海网箱中卵形鲳鲹发病的病原菌。

图 3 (Fig. 3)

图 3 4株菌株感染健康卵形鲳鲹的试验结果 Fig.3 Experiment results of four strains infected with healthy Trachinotus ovatus

菌株TOQZ01在LB液体培养基中37℃培养36 h后，菌液浓度达到9×10⁸ CFU/mL。将获得细菌胞外产物(ECPs)按浓度梯度分别加入各组的卵形鲳鲹TOHK细胞中，与对照组相比，实验组的细胞形态发生变化，正常状态下长梭形的TOHK细胞变圆、发生皱缩，并且从细胞培养板上脱落(图 4)。细胞活性检测结果显示，实验组中的细胞活性明显降低(图 5)，即菌株TOQZ01的细菌胞外产物(ECPs)对卵形鲳鲹TOHK细胞具有明显毒性。

图 4 (Fig. 4)

图 4 光学显微镜观察TOQZ01菌株的细菌胞外产物(ECPs)对卵形鲳鲹TOHK细胞的毒性作用 Fig.4 Light microscope observed the cytotoxicity of bacterial extracelluler products of TOQZ01 strain to TOHK cells in Trachinotus ovatus

图 5 (Fig. 5)

*P < 0.05，差异显著; **P < 0.01，差异极显著 A P value < 0.05 was considered statistically significant (*P < 0.05, **P < 0.01) 图 5 细胞活性检测TOQZ01菌株的细菌胞外产物(ECPs)对卵形鲳鲹TOHK细胞的毒性作用 Fig.5 Cell activity detected the cytotoxicity of bacterial extracelluler productes of TOQZ01 strain to TOHK cells in Trachinotus ovatus

2016年广西钦州湾近海网箱养殖的卵形鲳鲹发生以体表皮肤溃烂、皮下出血、内脏器官病变为典型症状的细菌性疾病，通过对患病卵形鲳鲹中病原菌进行分离、形态学观察、生理生化分析，分子生物学鉴定，证实分离得到的4株菌株(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)均为溶藻弧菌。进一步的回归实验证实，这4株溶藻弧菌是此次卵形鲳鲹发病的病原菌。在细胞水平上的检测结果证实，分离获得的溶藻弧菌的细菌胞外产物(ECPs)对卵形鲳鲹TOHK细胞具有明显的细胞毒性，这与卵形鲳鲹和石斑鱼等世界主要海水养殖鱼类受到溶藻弧菌感染后出现出血性溃疡、内脏器官肿大病变的组织病理学结果相一致，即溶藻弧菌在感染和增殖过程中向胞外释放的代谢产物(细菌毒素)，不仅干扰并破坏鱼体正常新陈代谢，而且对鱼体造成严重的细胞和组织损伤^[15-16]。

目前对养殖鱼类细菌性疾病的诊断方法主要包括基于细菌学和组织病理学的传统观察法，基于抗体的免疫学检测方法，以及分子生物学技术等^[17]。这些方法各有优点，但同时也存在操作繁琐、耗时长、仪器试剂昂贵或精确度不高等不足，无法达到现场快速准确检测诊断的要求。因此应着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水产致病菌快速检测技术，同时研发新型高效、绿色环保的抗菌药物，这对于及早发现、确定病原，进而有的放矢地制定治疗方案来控制溶藻弧菌的扩散、降低损失至关重要^[18]。未来我们将基于本研究中分离得到的溶藻弧菌开展病害快速检测技术和防控技术等现代海水生态健康养殖关键技术研究，以实现对广西海水养殖溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。

从广西钦州湾网箱养殖的发病卵形鲳鲹中分离得到的4株溶藻弧菌(TOQZ01，TOQZ02，TOQZ03，TOQZ04)，回归实验证实溶藻弧菌是此次卵形鲳鲹发病的病原菌，溶藻弧菌TOQZ01的细菌胞外产物(ECPs)对卵形鲳鲹头肾组织细胞系具有明显细胞毒性。未来将针对广西卵形鲳鲹中分离得到的溶藻弧菌开展病害快速检测技术和防控技术的研究，以实现对广西海水养殖溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。