2017, Vol. 24 
2. 广西科学院广西红树林研究中心，广西红树林保护与利用重点实验室，广西北海 536000
2. Guangxi Key Lab of Mangrove Conservation and Utilization, Guangxi Mangrove Research Center, Guangxi Academy of Sciences, Beihai, Guangxi, 536000, China
【研究意义】红树林是生长在热带和亚热带潮间带，以红树植物为主体的潮滩湿地生物群落，具有很高的生态价值，在全球16种主要生态系统中排名第四[1]，红树林保护已受到高度重视。林内挖捕经济动物是红树林人为破坏的主要因子[2]，开展不破坏红树林的林下水产养殖替代林内挖捕活动，是兼顾生态保护和经济发展的有效途径[3]，“红树林地埋管道生态养殖”即是在这一理念下研发的不破坏红树林的林下水产养殖新模式[4]，目前的主要养殖品种是中华乌塘鳢(Bostrychus sinensis)，一种名贵的海水鱼类。鱼类血液的生理生化指标常被用于鱼的健康状况评价和疾病诊断，其受到诸多因素的影响，如环境胁迫、养殖密度、饵料质量及饲养管理、应急反应等。红树林土壤低pH值和高硫化物含量的酸性硫酸盐土壤性质[5]，是开展红树林林下水产养殖的环境胁迫因子，故有必要研究养殖物种对这一特殊环境的适应性。【前人研究进展】鱼类不同种及同种野生与养殖群体间，血液生理生化指标存在显著差异[6-9]。环境条件(水温、盐度、pH值、溶氧等)、营养状况(食物供给、营养结构、添加剂及药物等)、水质污染(氨氮、亚硝酸盐、重金属等)、机械损伤、病害、应急反应，以及种间种内竞争等因素，都能导致鱼类血液生理生化指标变化[10-12]。酸胁迫使泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)红细胞(RBC)数量降低、白细胞(WBC)数量增加[13]，黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)血红蛋白下降、红细胞脆性增大[14]。硫化物胁迫导致大盖巨脂鲤(Colossoma macropomum)红细胞数量和血红蛋白含量降低[15]、滨岸护胸鲶(Hoplosternum littorale)血液氧化酶活性降低[16]。【本研究切入点】中华乌塘鳢的生物学特性，以及与人工繁殖和养殖相关方面已有一定的研究基础。血液学研究方面仅戈薇等[17]研究了血细胞的形态和白细胞分类计数。血液生理生化指标，以及其对酸和硫化物胁迫响应等的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】测定并比较野生、红树林地埋管道生态养殖和池塘养殖的中华乌塘鳢血液生理生化指标，通过胁迫实验探究其对酸和硫化物胁迫的响应，丰富中华乌塘鳢血液学研究的基础数据，为中华乌塘鳢红树林生态养殖提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料不同群体比较用鱼均于2016年9月在广西防城港市沿海采集，选择健康无伤、反应灵敏、大小规格基本一致的野生、红树林地埋管道生态养殖、池塘养殖的中华乌塘鳢成体进行分析。野生群体购自江平镇山心村，渔民用蜈蚣笼捕获；红树林地埋管道生态养殖群体由位于江山乡石角埠的广西红树林研究中心珍珠港滨海生态实验站提供；池塘养殖群体购自茅岭乡大陶村。所有实验鱼用泡沫箱低温保湿干运回实验室，用盐度为20‰的半海水微充气暂养24 h后取血测定，暂养期间不喂食，半海水为经自来水调节盐度的砂滤海水。胁迫实验用鱼取自红树林地埋管道生态养殖群体，2016年8月采集200尾，平均体重(121.27±10.77) g。
1.2 方法 1.2.1 采血和血样处理用含80 mg/L间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)的半海水浸泡待测鱼8~10 min，待鱼麻醉后取出，从尾静脉抽血。每尾抽取约1.5 mL血液，将一部分血液置于含有EDTA-K2的1.5 mL抗凝EP管中，用于血细胞计数和制作血涂片；另一部分血液缓慢注入另一个1.5 mL已编号预冷的干净EP管中，室温放置0.5 h后转入4℃冰箱过夜，在4℃、10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液用于生化指标测定。
1.2.2 血细胞分类与计数血细胞计数：分别用红细胞计数液和白细胞计数液稀释后，在血球计数板上进行红细胞计数与白细胞计数。
白细胞分类计数：血涂片瑞氏染色(Wright’s stain)，油镜随机观察200个白细胞，记录各种白细胞的个数并照相。
1.2.3 生化指标测定血清总蛋白(TP)含量测定采用乙醇沉淀-二喹啉甲酸法[18]，单位为mg/mL；超氧化物歧化酶(SOD)活力测定采用羟胺发色法[19]，每分钟每毫升血清抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位(U/mL)；谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活力测定参照程佩兰等[20]的方法，每分钟每毫升血清催化1 μmol/L 1-氯-2, 4-二硝基苯(CDNB)与GSH结合的酶量为一个活力单位(U/mL)；总抗氧化能力(T-AOC)测定采用铁离子还原法(FRAP)[21]，单位为每毫升血清还原三价铁离子的微摩尔数(μmol/mL)。
1.2.4 胁迫实验实验鱼养于规格为60 cm×30 cm×50 cm(长×宽×高)的无毒长方形聚乙烯水箱内，养殖用水为砂滤海水经自来水调节后的盐度为20‰的半海水，pH值为8.0±0.5，水温控制在(26±1)℃。实验用鱼运回实验室后，先暂养3 d，期间连续充气，头2 d每天投喂新鲜海虾肉，第3天不喂食，每天换水。
酸胁迫用1 mol/mL的HCl和1 mol/mL的NaOH调节养殖水体的pH值，设置水体pH值分别为4.0，5.5和7.1的3个胁迫组，另设1个未调节pH值的对照组(pH值为8.0±0.5)。硫化物胁迫用1 g/L的Na2S溶液为母液调节养殖水体硫化物浓度，设置水体硫化物表观浓度分别为500 μg/L、1 225 μg/L和3 000 μg/L的3个胁迫组，另设1个不添加硫化物的对照组。根据预实验测定的3个不同浓度梯度组中硫化物随时间的衰减量，每4 h补充1次硫化钠母液，以维持实验水体相对稳定的硫化物表观浓度。每组设2个平行，每个平行12尾实验鱼。分别在胁迫开始后0 h、24 h、48 h和72 h从各组中取出实验鱼6尾，采血测定生理生化指标。胁迫实验期间不喂食，不换水。
1.2.5 统计方法所有数据先用Microsoft Excel整理，然后用SPSS19.0统计软件进行方差分析(ANOVA)和LSD均值多重比较，所有结果均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 不同群体中华乌塘鳢血液生理生化指标比较如表 1所示, 在血细胞数量方面，野生、红树林地埋管道生态养殖和池塘养殖中华乌塘鳢3个群体间红细胞数量均差异显著，表现为池塘养殖群体＞红树林地埋管道生态养殖群体＞野生群体；白细胞数量无显著性差异。在白细胞组成方面，3个群体的中性粒细胞数和淋巴细胞数之和均占白细胞总数的95%以上；中性粒细胞占比野生群体显著高于两个养殖群体，淋巴细胞占比野生群体显著低于两个养殖群体；单核细胞和血栓细胞占比均极低，3个群体间无显著性差异。野生群体的血清总蛋白含量显著低于两个养殖群体，总抗氧化能力显著高于两个养殖群体，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽巯基转移酶活力在3个群体间均无显著差异。
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表 1 不同群体中华乌塘鳢的血液生理生化指标 Table 1 The blood physiological and biochemical parameters in Bostrychus sinensis in different groups |
硫化物胁迫的影响如图 1所示。白细胞和红细胞数量，低浓度组72 h内无显著变化; 中、高浓度组白细胞数增加，红细胞数减少，分别于24 h、48 h达到与对照组显著差异水平，增/减速度和强度与硫化物浓度正相关。SOD活力，低浓度组72 h内无显著变化; 中浓度组24 h后持续上升，72 h达到与对照组差异显著水平; 高浓度组24 h后持续降低，48 h达到与对照组差异显著水平。GST活力，低浓度组72h内无显著变化; 中、高浓度组表现为上调，分别于72 h、48 h显著高于对照组。TP含量，低浓度组72 h内无显著变化; 中、高浓度组表现为上调，均于72 h显著高于对照组。T-AOC则是先上升后下降，3个浓度组表现一致，24 h显著高于对照组，48 h回落至与对照组相当，72 h显著低于对照组。
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*表示与对照组相比差异显著(P＜0. 05) *Indicate significant differences between values which compared with control (P < 0. 05) 图 1 硫化物对中华乌塘鳢血液生理生化指标的影响 Fig.1 Effect of sulfide on blood physiological and biochemical parameters in Bostrychus sinensis |
如图 2所示，酸胁迫下中华乌塘鳢血液白细胞数增加，红细胞数减少；pH值为4.0和5.5处理组的白细胞数分别在24 h和48 h开始显著高于对照组，红细胞数分别在48 h和72 h开始显著低于对照组。SOD活力持续下降，pH值为4.0和5.5处理组分别在24 h和48 h达到显著差异差异水平。GST活力增强，pH值为4.0和5.5处理组均在24 h达到显著水平，然后维持在高活力状态。pH值为4.0处理组TP含量升高，其余处理组均无显著影响。T-AOC总体表现为下调，pH值为4.0和5.5处理组分别在24 h和48 h达到显著水平，后维持在较低水平，pH值为7.1处理组24 h后开始下调，48 h显著低于对照组，72 h又回复至与对照组持平。
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*表示与对照组相比差异显著(P＜0. 05) *Indicate significant differences between values which compared with control (P < 0. 05) 图 2 酸对中华乌塘鳢血液生理生化指标的影响 Fig.2 Effect of acid stress on blood physiological and biochemical parameters in Bostrychus sinensis |
正常健康的鱼类的血液生理生化指标一般会维持在一个相对稳定范围内，在受到病原体入侵或水体理化因子剧烈变化等胁迫时会发生改变[22]。在不良的环境条件下，野生鱼会采取逃离的方式应对，而养殖鱼只能通过调节自身生理状况适应胁迫因子的长期作用。在本研究所测定的10项中华乌塘鳢血液生理生化指标中，红树林地埋管道生态养殖群体与池塘养殖群体间仅红细胞数量1项存在显著差异，而野生群体与养殖群体间有5项存在显著差异，说明中华乌塘鳢血液生理生化指标对红树林地埋管道生态养殖环境的响应与池塘养殖基本一致。
红细胞数量，池塘养殖群体＞红树林地埋管道生态养殖群体＞野生群体，可能与食物获取和养殖水体溶氧等有关。饥饿会导致红细胞数量降低，低溶氧诱导红细胞数量增加[12]。野生群体生活在自然环境中，水体溶氧高，食物依靠捕捉，经常处于饥饿状态。红树林地埋管道生态养殖是一种依靠潮汐能驱动的长流水养殖，但每天有几小时水体不流动，水体溶氧相对较低，食物部分来源于进入系统的天然小鱼虾贝，部分来源于人工投喂，食物供给较有保障[23]。池塘养殖未充氧，养殖水体溶氧最低，人工投喂，食物供给充足。鱼类白细胞的主要功能是参与机体的免疫活动，在受到病原体侵袭或有害物质胁迫时，白细胞数量和不同类型白细胞的比例会发生变化。野生、红树林地埋管道生态养殖和池塘养殖3个群体的白细胞数量无显著差异，这与实验鱼均选择反应灵敏的健康无伤个体相吻合。本研究结果中华乌塘鳢白细胞中性粒细胞和淋巴细胞占绝大部分，单核细胞与血栓细胞数量极少，与戈薇等[17]的报道一致。中性粒细胞主要参与非特异性免疫，而淋巴细胞主要参与特异性免疫，野生群体的中性粒细胞比例显著高于养殖群体，而淋巴细胞显著低于养殖群体，养殖群体淋巴细胞的百分比高，可能是适应养殖环境的慢性应激反应，暗示养殖环境存在某类特定的胁迫因子。本研究中两个中华乌塘鳢养殖群体的血清总蛋白含量均显著高于野生群体，与齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)[6]的表现相似，可能与养殖群体食物充足、运动量小，而野生群体时常饥饿、捕食运动量大有关。
3.2 中华乌塘鳢血液生理生化指标对酸或硫化物胁迫的响应分析酸或硫化物均能导致中华乌塘鳢产生毒理反应，总体表现为中华乌塘鳢血液红细胞数减少，白细胞数增加，SOD活力降低，GST活力增强，TP含量升高，T-AOC下降，胁迫强度和持续时间与毒理反应强度呈正相关，水体pH值达到5.5或硫化物含量达到1 225 μg/L即能引起急性毒理反应。值得注意的是中华乌塘鳢血液SOD活力在3 000 μg/L、1 225 μg/L和500 μg/L的硫化物胁迫下，分别表现为持续降低、持续增加和无显著变化，而在pH值为4.0和5.5的酸胁迫下均表现为持续降低，说明对不同的胁迫因子、不同的胁迫强度有不同的响应规律。另外，由于胁迫实验过程中不喂食，后期对照组的红细胞数和SOD活性较初期有小幅度下降，这可能是饥饿的影响。
3.3 中华乌塘鳢对红树林林下养殖的耐受性分析虽然红树林土壤中硫含量为90~809 mg/kg，平均含量214 mg/kg，pH值为2.98~7.5，平均5.99[24]，但红树林地埋管道生态养殖是一个相对封闭的系统，养殖水体与红树林土壤没有接触，仅在红树林被潮水浸淹时与海水有交换，养殖水体的硫化物含量与pH值与土壤的关联度不强。在多年的生产过程中，检测到的养殖水体的最高硫化物含量为34.82 μg/L，最低pH值为6.8[23]，均远低于对中华乌塘鳢产生毒性反应的胁迫强度。
4 结论红树林区野生和养殖中华乌塘鳢群体血液生理生化指标差异显著，但红树林地埋管道生态养殖和池塘养殖群体总体相当，中华乌塘鳢血液生理生化指标对红树林地埋管道养殖环境的响应与池塘养殖基本一致。水体硫化物浓度1 225 μg/L及以上、pH值5.5及以下会危害中华乌塘鳢健康状况。硫化物和酸不是红树林地埋管道生态养殖的限制因子，但仍是潜在的危害因子。
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