0 引言

【研究意义】近年来，中草药提取物的药用研究尤其是消炎止血方面的研究受到了广泛关注。该领域研究方法多样，筛选方法不一，即使是同一种草药提取物，其止血等活性的评价结果也不一致。【前人研究进展】彭凯等^[1]选用血浆活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间和纤维蛋白原指标, 比较荷叶3种不同炮制品提取物对大鼠凝血功能的影响; 李高申等^[2]选用血浆复钙时间从冬凌草中寻找具止血活性成分; 杨瑞芳等^[3]使用小鼠出血时间和凝血时间研究卷柏炒炭前后的止血效果。但如果仅选择几种指标进行测试，往往不能全面反映中草药止血效果。【本研究切入点】综合多种指标，探寻合适且有效的方法筛选具有止血活性的中草药提取物。【拟解决的关键问题】借鉴前人研究，选择凝血酶时间、血小板聚集率和粘附率、抗凝血酶活性测试、血浆复钙时间、最低抑菌浓度、最低杀菌浓度, 建立综合评价模型，为筛选具有止血活性的中草药提供方法。

1 材料与方法 1.1 材料

中草药：侧柏叶(批号20140301)、三七(批号20141211)、两面针(批号20150122)。样品粉碎，过40目筛，干燥，备用。

实验动物：健康家兔，体重3.0~3.5 kg，雌雄兼备；昆明小白鼠220只，体重18~22 g，雌雄各半，购自广西医科大学动物实验中心。

供试菌株：变异链球菌(ATCC25175)、牙龈卟啉单胞菌(ATCC33277) 购自广东省微生物菌种保藏中心。

试剂：牛脑心浸液肉汤培养基(BHI培养基)、CDC厌氧菌琼脂、定标血浆(美国IL公司)、止血环酸由柳州两面针有限公司提供，其它试剂均为分析纯。

1.2 方法 1.2.1 体外止血效果综合评价模型的建立

(1) 止血评价指标体系的确定

选择从事生物学研究、动物临床实验和药理研究的多名专业人员，对初步确定的止血评价指标进行征询。结合专家意见，再根据评价指标体系科学性、代表性、层次性、可操作性及可比性原则^[4]确定评价一级指标与二级指标。将止血效果评价目标层的一级指标概括为抗菌作用、体外凝血效果，见表 1。以口腔牙龈出血为例，致龋菌(变异链球菌，Streptococcus mutans)与致牙周病菌(牙龈卟啉单胞菌，Porphyromonas gingivalis)均可引起牙龈出血，因此选中草药对两株菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)作为抗菌作用的二级指标。凝血最直观地表现是血液凝固，凝血酶是血液凝固的核心；血小板聚集率(Platelet aggregation rate, PAgR)和黏附率(Platelet adhesion rate, PAdR)发生在血管受损处，因黏着和聚集而产生血栓；血浆复钙时间Recovery calcium time, RT)代表内源性凝血系统最终可生成凝血酶达到止血效果；抗凝血酶Ⅲ(Anti-thrombin Ⅲ, AT-Ⅲ)能抑制凝血酶活性起到抗凝作用。因此选中草药凝血酶时间(Thrombin time, TT)、PAgR、PAdR、RT、AT-Ⅲ活性作为止血作用的二级指标。

(2) 各评价指标权重的确定及一致性检验

确定权重：利用“1~9”标度法建立判断矩阵，赋值并求出判断矩阵的最大特征值和所对应的特征向量，用归一化法求得权重值^[4]。

一致性检验：计算判断矩阵一致性指标(C.I.)及一致性比例(C.R.)。当C.R.＜0.1时，认为判断矩阵的一致性是可以接受的；否则要对判断矩阵做适当修正。根据式C.I.=(λ_max-m)/(m-1) (式中，m为判断矩阵的阶数)与C.R.=C.I./R.I.检验总排序的一致性。

(3) 评价因子的分级

用模糊综合评判进行定量化处理给出评价因子的分级标准：咨询专家后给出各因子的分级标准。按照5级评分法，将评价等级分为优、良、一般、较差、很差5个等级，分别赋值5分、4分、3分、2分、1分。具体分级标准见表 2。

(4) 综合止血评价计算

在明确评价因子的权重后，根据分级标准确定各评价因子水平值，依式1) 计算其综合止血效果。

$Y = \sum {UijWij\left( {i,j = 1,2,3,n} \right)} ,$

(1)

式中：Y表示综合止血效果，Uij表示某评价因子的权重值，Wij表示中草药评价因子的得分值。

(5) 止血效果综合评价指数计算

${Y_{\rm{o}}} = \sum {5 \times Uij\left( {i,j = 1,2,3,n} \right)} ,$

(2)

式中：Y_o表示止血效果理想值。各参评因子理想水平值均为5分。根据式3) 计算出综合止血评价指数。

${\rm{CEI = }}{Y/}{Y_{\rm{o}}},$

(3)

式中：CEI为综合止血评价指数，Y为综合止血效果，Y_o为综合止血效果理想值。

(6) 评价结果分类

以CEI为分级依据，按照差值百分比分级法划分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。Ⅰ级表示止血效果好，等级在60%~100%；Ⅱ级表示止血效果较好，等级在40%~60%；Ⅲ级表示止血效果一般，等级在30%~40%；Ⅳ级表示止血效果差，等级在0~30%。

1.2.2 提取物凝血测试

(1) 中草药提取

取侧柏叶、三七、两面针适量，与超纯水按1:10的比例室温浸泡2 h，回流提取2次，每次2 h，滤渣超声提取40 min，合并滤液，旋蒸浓缩，冷冻干燥。

样品液配制：配制10 mg·mL^-1的侧柏叶、三七、两面针提取物及止血环酸溶液，经一次性进口滤器过滤成清亮的提取液。

抗凝血液的制备：兔耳缘静脉取血，立即与109 mmol·L^-1的枸橼酸钠9:1混匀，将含抗凝剂全血1 000 r·min^-1离心10 min，得富血小板血(PRP)；3 000 r·min^-1离心10 min，得贫血小板血浆(PPP)。

(2) 凝血酶时间(TT)测定

参考文献[5]方法测定TT。

(3) 血小板聚集率(PAgR)测试

参照文献[5]方法进行测定。

(4) 血小板粘附率(PAdR)测试

0.1 mL的PRP分别装于塑料离心管中0.1 mL与不同样品液混合，在每个离心管中加入3个大小相等的直径为3.0 mm的玻璃珠，振荡10 min，显微镜下用血球计数器计数。血小板黏附率(%)＝(黏附前血小板数－黏附后血小板数)/黏附前血小板数×100%，生理盐水做空白对照。

(5) 血浆复钙时间(RT)测定

0.1 mL生理盐水或样品液和0.1 mL PRP于离心管中混合，37℃水浴下加入0.1 mL质量分数为25 mmol·L^-1的CaCl₂溶液混匀并开始计时，有颗粒状或丝状物产生时停止计时^[6]。

(6) 抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)活性测定

参照汪宏良等^[7]凝固时间法制作凝固时间与AT-Ⅲ活性的标准曲线，得Y=0.040X-0.184, R²=0.999 4，可知AT-Ⅲ活性在25%~125%时，与凝固时间呈良好线性关系。测定样品血浆AT-Ⅲ活性。

(7) 提取物抗菌测试

菌悬液制备：将变异链球菌与牙龈卟啉单胞菌复苏48 h后，接种于BHI液体培养基中，37℃在85% N₂、10% H₂、5% CO₂的条件下于厌氧培养箱中培养24 h后，待细菌生长达到对数期，涂片镜检为纯培养后，收集菌液，调菌浓度1.0×10⁵~1.0×10⁶ CFU·mL^-1，备用。

二倍稀释法^[8]：将粗提物以倍比稀释法溶于BHI液体培养基中，配制成1 000 mg·mL^-1至0.488 mg·mL^-1的12组样品液(其中侧柏叶初始浓度为1 200 mg·mL^-1)，取样品液100 μL加入每孔各有100 μL菌悬液的无菌96孔板中(相当于培养体系中提取物浓度为500 mg·mL^-1至0.244 mg·mL^-1)作为实验组；另取样品液100 μL加入BHI液体培养基100 μL作为对照组。将96孔板37℃厌氧培养培养24 h，肉眼观察无浑浊出现的最低药物浓度为最低抑菌浓度(MIC)值，挑取肉眼观察可能无细菌生长的溶液，划线于CDC血平板，37℃厌氧培养，观察培养24 h平板上有无菌落生长，无菌生长的浓度即为最低杀菌浓度(MBC)。

1.2.3 模型验证

灌胃样品液配制：适量样品粉末加0.5%的羧甲基纤维素钠混悬0.2 mL。配制浓度分别为5 g生药·kg^-1、10 g生药·kg^-1、15 g生药·kg^-1，止血环酸作为阳性对照，灌胃量为130 mg·kg^-1。草药提取物对小鼠出血时间与凝血时间的测试参考曲香芝等^[9]的方法进行。

2 结果与分析 2.1 评价模型指标权重及一致性检验

采用“1~9”标度法构造止血模型和各指标的判断矩阵，结果如下：

${A_u} = \left( {\begin{array}{*{20}{c}} 1&1&1&1&{1/4}&{1/2}&{1/2}&{1/4}&{1/4}\\ 1&1&1&1&{1/4}&{1/2}&{1/2}&{1/4}&{1/4}\\ 1&1&1&1&{1/4}&{1/2}&{1/2}&{1/4}&{1/4}\\ 1&1&1&1&{1/4}&{1/2}&{1/2}&{1/4}&{1/4}\\ 4&4&4&4&1&2&2&1&1\\ 2&2&2&2&{1/2}&1&1&{1/2}&{1/2}\\ 2&2&2&2&{1/2}&1&1&{1/2}&{1/2}\\ 4&4&4&4&1&2&2&1&1\\ 4&4&4&4&1&2&2&1&1 \end{array}} \right)。$

各指标的权重系数可以将矩阵A_u的内容按式4) 进行处理后，根据式5) 由归一法求得。

${b_i} = \left( {\prod\limits_{j = 1}^9 {{a_{ij}}} } \right)1/9,$

(4)

${u_i} = {b_i}/\sum\nolimits_{i = 1}^9 {{b_i}} 。$

(5)

一致性检验结果：经计算总排序的C.I.=0，R.I.=1.345 0^[4]，C.R.=0＜0.1，说明总排序满足一致性。

2.2 体外止血效果评价

样品凝血与抗菌指标测试结果见表 3。止血测试表明：与生理盐水相比，4种样品的TT、RT均缩短，PAgR和PAdR均增加，AT-Ⅲ活性均减小，说明4种样品均能促凝血酶活性，促进血小板聚集与粘附，影响内源性凝血系统，抑制AT-Ⅲ活性达到体外促凝效果。抗菌实验表明：侧柏叶变异链球菌与牙龈卟啉单胞菌的抗菌效果均较好，均出现抑菌与杀菌效果，MIC均为150 mg·mL^-1，MBC均为600 mg·mL^-1；其次为两面针，仅出现对变异链球菌的抑菌作用，MIC为250 mg·mL^-1。此外，5项凝血测试发现，不同样品可通过不同的止血途径，联合或单独起到体外止血的作用。与生理盐水相比，侧柏叶、止血环酸、两面针均能够明显的缩短TT(P＜0.05) 与RT(P＜0.05)，促进PAgR(P＜0.05) 与PAdR(P＜0.05)，抑制AT-Ⅲ活性(P＜0.05)，达到体外凝血效果。将所测实验数据代入模型，所得各样品液综合止血评价结果见表 4。可以看出，在10 mg·mL^-1浓度下，止血效果好的为侧柏叶、三七、止血环酸；止血效果较好的为两面针；止血效果差的为生理盐水。

2.3 止血模型验证

由表 5知，3种剂量的侧柏叶组均显著地缩短小鼠出血时间与凝血时间，且剂量越高，效果越好；三七组低中剂量对小鼠出血与凝血的缩短效果比高剂量显著；两面针中高剂量时，才显著地缩短出血与凝血时间。样品所用剂量越低，对小鼠出血时间与凝血时间越短，说明该样品的止血效果越好。各样品低剂量的出血与凝血时间表明，三七与侧柏叶的止血效果比两面针好，这也与模型结论一致。

3 结论

本研究考察了侧柏叶、三七、两面针、止血环酸4种样品对血浆复钙时间、血小板聚集与粘附、凝血酶及抗凝血酶Ⅲ活性的影响，发现4种样品均在不同程度上缩短血浆复钙时间(影响内源性凝血系统)；促进血小板的聚集与粘附(加快血液凝固)；影响凝血酶活性并抑制抗凝血酶Ⅲ的活性等。此外，侧柏叶提取物对口腔致病菌变异链球菌及牙龈卟啉单胞菌有明显的杀菌作用，两面针仅可以抑制变异链球菌的生长，而三七无抗菌效果。已有研究表明，中草药提取物中的黄酮、生物碱、皂苷等活性成分具有止血、抗菌等作用^[10-11]，因此，本实验中几种中草药抗菌止血活性的不同，可能是这几类成分的含量不同所致。三七的主要活性成分为三七总皂苷，而高剂量的三七总皂苷可显著抑制血小板聚集与粘附，具有抗血栓的作用^[12]，本实验也发现15 g生药·kg^-1的三七与生理盐水相比有延长小鼠出血和凝血时间的趋势，即存在抗血栓的作用。

本研究还对3种中草药进行体外凝血及抗菌实验，建立体外止血模型，将所得检测数据运用到模型中，得到各样品的体外止血效果评价结果，止血效果好的为侧柏叶、三七、止血环酸；止血效果较好的为两面针；止血效果差的为生理盐水。小鼠出血及凝血实验发现，几种中草药与空白组相比均可缩短小鼠出血和凝血时间从而达到止血效果。样品止血的效果好坏与体外评价模型的结果基本一致。表明建立与动物实验相吻合的体外止血评价模型，解决了止血中草药筛选时工作量大，耗时耗力等缺点，为今后筛选具有高止血活性的中草药提供方法。此外，根据不同出血情况可选择不同细菌如皮肤等外伤出血可选择其它致感染细菌带入模型，即改变抗菌评价指标，这也体现了所建模型灵活的适应性。