广西科学  2017, Vol. 24 Issue (4): 382-388   PDF    
引用本文
赵艳飞, 宋志飞, 王贤丰, 聂振平, 童潼, 杨家林, 苏琼. 亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹相关免疫指标的影响[J]. 广西科学, 2017, 24(4): 382-388.
ZHAO Yanfei, SONG Zhifei, WANG Xianfeng, NIE Zhenping, TONG Tong, YANG Jialin, SU Qiong. Effects of Acute Nitrite Exposure on Immunity Indicators in Scylla paramamosain[J]. Guangxi Sciences, 2017, 24(4): 382-388 .
亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹相关免疫指标的影响
赵艳飞, 宋志飞, 王贤丰, 聂振平, 童潼, 杨家林, 苏琼     
广西壮族自治区海洋研究所，广西海洋生物技术重点实验室，广西 北海 536000
收稿日期: 2017-04-11; 网络优先数字出版时间: 2017-05-22
* 广西科学研究与技术开发项目(桂科合1599005-2-18, 桂科能1598020-10, 桂科AB16380105, 桂科合14125008-2-20) 资助
作者简介: 赵艳飞(1988-)，男，硕士，主要从事海水养殖研究
**通信作者: 聂振平(1962-)，男，工程师，主要从事海水养殖及育苗方面的研究, E-mail：gzz_1985@sina.com
摘要: 【目的】 探讨亚硝酸盐急性胁迫对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)机体免疫力的影响，为拟穴青蟹养殖模式调整与产业化升级提供基础资料。【方法】 测定拟穴青蟹在不同浓度亚硝酸盐(0 mg/L、20 mg/L、60 mg/L、100 mg/L、140 mg/L)胁迫下其组织中碱性磷酸酶(AKP)活力、过氧化氢酶(CAT)活力、丙二醛(MDA)含量在受胁迫48 h内的动态变化。【结果】 亚硝酸盐胁迫浓度达60 mg/L以上时，青蟹肝胰腺及肌肉中AKP活力变化显著，肌肉中AKP活力随时间增加呈先升高后降低趋势，各组织中CAT活力变化也呈先升高后降低趋势，表现出一定的“毒兴奋效应”，肝胰腺及鳃中MDA含量则随胁迫时间与胁迫浓度变化呈递增趋势。【结论】 亚硝酸盐胁迫可通过破坏组织中非特异性免疫酶类体系运转，加剧组织中脂质过氧化方式导致机体免疫力下降。在拟穴青蟹人工养殖中，将亚硝酸盐浓度控制在20 mg/L以下，有助于青蟹养殖模式调整与产业化升级。
关键词: 拟穴青蟹     亚硝酸盐胁迫     碱性磷酸酶     过氧化氢酶     丙二醛    
Effects of Acute Nitrite Exposure on Immunity Indicators in Scylla paramamosain
ZHAO Yanfei , SONG Zhifei , WANG Xianfeng , NIE Zhenping , TONG Tong , YANG Jialin , SU Qiong     
Guangxi Key Laboratory for Marine Biotechnology, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai, Guangxi, 536000, China
Abstract: 【Objective】 To investigate the effect of ambient nitrite on the immunity response, and to provide the basic data for the adjustment and industrialization of Scylla paramamosain, this nitrite stress experiment was designed. 【Methods】 In this experiment, mud crabs were divided into four nitrite exposed groups(20 mg/L, 60 mg/L, 100 mg/L and 140 mg/L ambient nitrite concentrations)and control group. Alkaline phosphatase(AKP) activity, catalase(CAT) activity and malodiadehyde(MDA) content were measured after 3 h, 6 h, 12 h, 24 h and 48 h stress. 【Results】 The results showed that after treated in high concentration (above 60 mg/L) nitrite exposure, AKP activity varied significantly in hepatopancreas and muscle. With the increase of time, AKP activity in muscle increased first and then decreased, which was similar with the variation tendency of CAT activity in three organizations, indicating a poison-intoxication effect. The content of MDA in hepatopancreas and gills increased with the stress time and stress concentration. 【Conclusion】 Therefore, nitrite stress could decrease the immunity of mud crab by damaging enzymes system related to non-specific immunity and accelerating lipid peroxidation. In the artificial breeding of mud crabs, it would contribute to breeding pattern adjustment and industrial upgrading if the concentration of nitrite was controlled below 20 mg/L.
Key words: Scylla paramamosain     nitrite stress     alkaline phosphatase     catalase     malodiadehyde    
0 引言

【研究意义】拟穴青蟹是我国主要的海水养殖种类之一，年养殖产量在我国海水甲壳类养殖中常年位居第二[1]，在其持续大规模养殖过程中，也暴露出一些问题：养殖水环境不断恶化，病害日趋严重。海水养殖业规模不断扩大，近岸海水中氮含量也逐渐升高。在人工养殖环境中，水体中无机氮主要存在形式之一是亚硝酸盐。受养殖水体中溶解氧等因素影响，其含量居高不下，甚至可达50 mg/L以上[2]。水生动物长期暴露于高浓度的亚硝酸盐水体中，可导致免疫力下降，更易感染病原菌，并引起大规模疾病发生[3-4]，这也是当前青蟹养殖高发病率、高死亡率的重要原因[5-6]，严重制约了青蟹高密度工厂化养殖模式的开展与青蟹养殖产业健康升级。【前人研究进展】目前国内外已对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、红螯光壳螯虾(Cherax quadricarinatus)等多种甲壳类[7-9]及各种鱼类[10-11]等开展亚硝酸盐胁迫相关研究，拟穴青蟹也已开展群体遗传多样性[12]、性腺发育等[13]研究，然而在亚硝酸盐胁迫相关研究中，亚硝酸盐胁迫设定浓度梯度范围仅为0~2.37 mg/L[6]，这远不能得出高密度养殖水体中亚硝酸盐剧烈波动会对拟穴青蟹造成影响的结论。【本研究切入点】以亚硝酸盐为胁迫因子对拟穴青蟹进行胁迫实验，研究高浓度的亚硝酸盐胁迫对青蟹免疫及代谢的影响。【拟解决的关键问题】设定不同亚硝酸盐浓度梯度，并对拟穴青蟹不同组织中碱性磷酸酶(AKP)活力、过氧化氢酶(CAT)酶活力及丙二醛(MDA)含量在不同时间段的变化进行统计分析，探讨亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹生理生化与免疫反应的影响，以期为蟹类环境胁迫研究积累资料，为拟穴青蟹养殖模式调整与产业化升级提供基础资料。

1 材料与方法 1.1 材料

拟穴青蟹于2016年8月12日购自北海市竹林村养殖塘，规格：壳宽(8.12±0.57) cm，壳长(5.35±0.33) cm，体质量(117.25±13.48) g，并从中挑选附肢完整、健壮无病害的用于实验。于水泥池(2 m×2 m×1 m)中适应性驯养2周后开展实验，每池暂养5~6只，期间每日傍晚18:00左右投喂波纹横帘蛤(Paphia undulata)。驯养及实验用水为过滤后的自然海水，平均水温29~31℃，盐度29‰，pH值8.0~8.2，采用不间断充气方式，使溶解氧保持在6~7 mg/L，日换水量约为总暂养水体的1/3，实验开始后不再投饵、换水。

1.2 方法 1.2.1 实验设计

据报道，同一环境下同规格的拟穴青蟹对亚硝酸盐48 h半数致死浓度(48 h-LC50)为148.43 mg/L[14]，因此共设定4个亚硝酸盐浓度梯度胁迫组，即C20组、C60组、C100组、C140组，水中亚硝酸盐表观浓度依次为20 mg/L、60 mg/L、100 mg/L、140 mg/L。采用分析纯亚硝酸钠配制1 g/L母液并将各实验组调制理想值，同时另设一对照组(即C0)，不人为添加任何亚硝酸盐，每个浓度梯度有45只实验用蟹，各分3个平行，每个平行组分别于实验开始后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h随机取出2~3只个体进行采样，每个处理组在各时间段采样数及死亡数见表 1。

表 1 各实验组在各时间段内取样及死亡数(只) Table 1 The number of samples and fatalities in each experimental group in each sampling period (unit)
1.2.2 样品制备

拟穴青蟹于-20℃麻醉10 min后，置于冰上解剖并取出部分肝胰腺、肌肉、鳃，其中肌肉均取自左侧游泳足相连部位，鳃取自第2对鳃弓。组织样品经缓冲液(pH值7.4, 0.01 mol/L Tris-HCl, 0.000 1 mol/L EDTA-2Na, 0.01 mol/L蔗糖，0.8%NaCl溶液)冲洗并用吸水纸吸取表面水分，称重并制备10%匀浆液，4℃下3 000 r/min离心10 min后取上清液待测。

1.2.3 AKP、CAT活力及MDA含量测定

蛋白含量、AKP活力、CAT活力、MDA含量测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，具体操作见试剂盒说明书。

1.3 数据处理

实验数据以平均值±标准误表示，采用SPSS19.0软件中One-Way ANOVA进行单因素方差分析，Duncan法进行多重比较，取P＜0.05为差异显著性水平。

2 结果与分析

由表 1可知，亚硝酸盐急性胁迫24 h，未足48 h时，C140胁迫组青蟹均已死亡，故不再对C140组第48 h时AKP、CAT及MDA指标进行测定及分析。

2.1 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺、肌肉和鳃中AKP活力的影响

在亚硝酸盐胁迫下，拟穴青蟹肝胰腺、肌肉中AKP活力变化显著(P＜0.05)，鳃中AKP活力无显著性差异(P＞0.05)。

亚硝酸盐胁迫条件下，拟穴青蟹肝胰腺中AKP活力变化见表 2。同组比较可知，各处理组在胁迫3 h与胁迫6 h、12 h、24 h、48 h时其肝胰腺中AKP活力均呈显著性差异(P＜0.05)，且C20组在胁迫12 h以及C100组在胁迫6 h时，其肝胰腺中AKP活力显著升高，随后又逐渐下降；不同组间，随亚硝酸盐胁迫浓度升高，肝胰腺中AKP活力整体呈下降趋势；除C20组外，其余各组肝胰腺中AKP活力均显著低于对照组(P＜0.05)，且C60、C100、C140组在胁迫12 h后AKP活力不再具有显著性差异(P＞0.05)。

表 2 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺AKP活力的影响 Table 2 Effects of nitrite stress on AKP activity in the hepatopancreas of Scylla paramamosain

由表 3可知，随胁迫时间推移，拟穴青蟹肌肉中AKP活力呈现显著变化(P＜0.05)，其中C20组在胁迫6 h时AKP活力突然升高，在之后随胁迫时间增加而降低，其余各处理组，青蟹肌肉中AKP活力均随时间增加而逐步下降；相同胁迫时间下，在6 h时，C20组青蟹肌肉组织中AKP活力最大且显著高于对照组(P＜0.05)，胁迫12 h后，各实验组青蟹肌肉中AKP活力整体呈下降趋势，且表现出除C20组外，其余各组均显著低于对照组(P＜0.05)。

表 3 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肌肉AKP活力的影响 Table 3 Effects of nitrite stress on AKP activity in the muscle of Scylla paramamosain
2.2 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺、肌肉和鳃中CAT活力的影响

从表 4可以看出，随胁迫时间增加，除C20组，各处理组拟穴青蟹肝胰腺中CAT活力均呈现先升高后降低趋势，并在6 h时表现为最大值；C20组在各胁迫时间未出现显著性变化(P＞0.05)，与对照组也无显著性差异(P＞0.05)，但在胁迫24 h以后其肝胰腺中CAT活力高于其余各处理组并呈现显著性差异(P＜0.05)，在相同胁迫时间下，随胁迫浓度的升高，青蟹肝胰腺中CAT活力呈先升高后降低趋势，具体表现为C20组中青蟹肝胰腺中CAT活力整体高于对照组及各处理组。

表 4 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺CAT活力的影响 Table 4 Effects of nitrite stress on CAT activity in the hepatopancreas of Scylla paramamosain

由表 5可知。亚硝酸盐胁迫可导致青蟹肌肉中CAT活力短暂升高并显著高于对照组(P＜0.05)，且随胁迫浓度的升高，青蟹肌肉中CAT活力达最高值所需时间也越来越短。在胁迫48 h时，对照组与C20组差异显著(P＜0.05)，在其余胁迫时间下对照组与C20组无显著性差异(P＞0.05)。

表 5 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肌肉CAT活力的影响 Table 5 Effects of nitrite stress on CAT activity in the muscle of Scylla paramamosain

由表 6可知，随胁迫时间增加，C60、C100、C140组拟穴青蟹鳃中CAT活力不断下降，C20组却表现为先降低后升高趋势，在胁迫24 h以后，其余各处理组均显著低于对照组、C20组(P＜0.05)；C100组在胁迫3 h时与胁迫24 h、48 h相比差异显著(P＜0.05)；在各个胁迫时间下，C20组与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)。

表 6 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹鳃CAT活力的影响 Table 6 Effects of nitrite stress on CAT activity in the gill of Scylla paramamosain
2.3 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺、肌肉和鳃中MDA含量的影响

亚硝酸盐胁迫下，拟穴青蟹肝胰腺、鳃中MDA含量均出现显著性变化(P＜0.05)，肌肉中MDA含量变化不显著(P＞0.05)。由表 7可知，随胁迫时间增加，各处理组拟穴青蟹肝胰腺中MDA含量不断升高，除C20组外，其余处理组在各胁迫时间下肝胰腺组织中MDA含量均显著高于对照组(P＜0.05)；在相同胁迫时间下，随亚硝酸盐浓度升高，拟穴青蟹肝胰腺中MDA含量也呈升高趋势。

表 7 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹肝胰腺MDA含量的影响 Table 7 Effects of nitrite stress on MDA content in the hepatopancreas of Scylla paramamosain

如表 8所示，在亚硝酸盐胁迫下，各处理组拟穴青蟹鳃中MDA含量随胁迫时间与胁迫浓度的增加，呈显著上升趋势(P＜0.05)，与对照组相比，除48 h外，C20在其余胁迫时间下拟穴青蟹鳃中MDA含量均无显著性差异(P＞0.05)，C60在胁迫12 h以后开始与对照组呈现显著性差异(P＜0.05)，C100、C140组在各胁迫时间下均与对照组差异显著(P＜0.05)。

表 8 亚硝酸盐胁迫对拟穴青蟹鳃MDA含量的影响 Table 8 Effects of nitrite stress on MDA content in the gill of Scylla paramamosain
3 讨论

甲壳类动物体内生理与免疫系统正常运转与其所处水环境联系紧密，温度、pH值、亚硝酸盐浓度等环境因子的波动极易引起甲壳类应激反应，并导致自身免疫力下降，病菌易感性升高[15]。目前普遍高氮的养殖水体中，亚硝酸盐可由氨经亚硝化细菌作用转化而成，也可由硝酸盐经反硝化细菌转化而成，水中多种水化学因子均可通过影响这两种细菌而导致亚硝酸盐的积累[16]。

3.1 亚硝酸盐对拟穴青蟹各组织中AKP活力的影响

AKP为机体水解酶体系的组成部分，是机体物质代谢的重要酶类[17]，同时其在机体各级非特异性免疫应答中也起着重要作用[18]。当三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)受环境因子波动或病原入侵时，其体内血淋巴中AKP活性明显升高，并产生一系列适应性调节措施，进而发挥免疫功能[19]。李玉全等[20]对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行研究发现，当盐度骤变时，其体内AKP活力随时间推进有较大波动，进而对脊尾白虾磷代谢途径产生显著影响。本实验分析发现，当亚硝酸盐浓度达60 mg/L以上时，拟穴青蟹肝胰腺及肌肉中AKP活力变化显著，其中肌肉中AKP活力呈现先升高后降低的趋势，这表明拟穴青蟹受亚硝酸盐胁迫影响，可诱导其体内AKP活力升高，进而发挥免疫调节作用，当胁迫时间过长，浓度过高时，AKP活力显著降低，这表明高浓度亚硝酸盐可严重影响拟穴青蟹体内水解酶体系的正常运转，进而影响其机体抗病能力，这一结果与三疣梭子蟹[19]、红螯光壳螯虾[8]受环境胁迫所表现的的机体反应较为一致。

3.2 亚硝酸盐对拟穴青蟹各组织中CAT活力的影响

CAT为机体重要的抗氧化酶，与超氧化物歧化酶相互关联并联合清除体内活性氧自由基，使机体免受伤害，CAT活力下降，通常标志着机体清除自由基的能力下降[21]。本实验结果表明，拟穴青蟹在高浓度亚硝酸盐环境中，体内CAT活性变化趋势为先升高后降低，但在20 mg/L浓度下，其体内各组织中CAT活性非但没有下降，反而有升高趋势，表现为“毒性兴奋效应”[22]，这可能是低浓度亚硝酸盐可刺激拟穴青蟹机体内抗氧化酶体系的运转，进而使机体快速清除胁迫所产生的活性氧，增强机体抵抗力。黄海涛[14]通过对拟穴青蟹进行亚硝酸盐胁迫发现，低浓度亚硝酸盐不会对其蜕壳与存活率产生较大影响，甚至还有一定促进作用，高浓度组却可严重影响其存活与蜕壳，结合本实验分析，这可能也与上述“毒性兴奋效应有关”，但也说明高浓度亚硝酸盐可通过破坏抗氧化系统运转从而对拟穴青蟹产生严重危害。

3.3 亚硝酸盐对拟穴青蟹各组织中MDA含量的影响

MDA为脂质过氧化产物之一，被广泛用作氧化胁迫中细胞膜氧化损伤的评价指标[23]。有研究表明，亚硝酸盐等环境污染因子的波动可引起机体活性氧的增加[24]，而大量积累的活性氧自由基可进一步攻击周围生物分子，使蛋白变性、脂质过氧化，最终使机体抗病能力下降甚至死亡[25]。在本研究中，拟穴青蟹肝胰腺和鳃组织中MDA含量随胁迫时间增加、胁迫浓度升高而增高，这表明亚硝酸盐可促进拟穴青蟹机体内脂质过氧化的发生，进而对拟穴青蟹产生毒害作用，这与洪美玲等[7]对中华绒螯蟹研究结果一致。

4 结论

综上所述，高浓度的亚硝酸盐可通过破坏拟穴青蟹组织中AKP水解磷酸化作用，抑制机体内CAT的抗氧化效应，促进机体内脂质过氧化的发生，进而破坏拟穴青蟹生理生化、免疫系统及细胞膜的完整性，威胁着拟穴青蟹的健康生长。在拟穴青蟹人工养殖中，将亚硝酸盐控制在20 mg/L以下，将有助于青蟹工厂化养殖的发展，促进青蟹养殖模式的调整与产业化升级。

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