丝状真菌在工业生产过程中常用于酶、有机酸和抗生素等的生产，在生产商业酶制剂领域处于核心地位^[1]，一些重要的工业酶生产菌株如黑曲霉、米曲霉和里氏木霉都属于丝状真菌。丝状真菌具有表达量高、分泌效率高等特点，如里氏木霉在工业发酵中内源纤维素酶产量可高达100 g/L^[2]；同时，丝状真菌还能进行各种翻译后加工，如糖基化、蛋白酶的切割和二硫键的形成等修饰^[3]。有的丝状真菌在表达某些基因时产量很高，如里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ(CBH1) 占胞外分泌蛋白的50%左右^[4]，意味着这些基因的启动子能高效地驱动基因的转录和表达^[5]。然而丝状真菌在表达外源基因时，往往表达量较低。因此，采用基因工程的方法对启动子进一步改造获得转录效率更强的启动子，有可能提高外源基因的表达量^[6]。

启动子通常位于结构基因上游，作为基因的5′非编码DNA序列，转录因子能和其上特定基序 (motif) 进行特异识别、结合，进而招募RNA聚合酶启动基因的转录。按其驱动基因的表达形式，启动子分为两类：组成型启动子和诱导型启动子。根据不同的宿主菌和不同的目的基因，需选择不同类型的启动子指导目的基因的表达。在丝状真菌中高效表达外源基因，通常选择宿主细胞自身的强启动子进行转录，使用较多的如里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ基因 (cbh1) 启动子、曲霉糖化酶基因 (glaA) 启动子和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因 (gpdA)^[7]启动子等。由于丝状真菌表达外源基因常常效率较低，对这类组成型或诱导型强启动子均有必要进行改造来提高外源基因的表达量。已有文献报道采用基因工程法改造启动子的确能提高下游基因的表达^[8]。

基因工程法改造启动子的方式多样，主要包括定点突变、区段操作、易错PCR、DNA shuffling和核苷酸类似物突变等。定点突变法是根据启动子上结合基序特征和已知的调控机理，对启动子特定序列进行突变改造，所得到的突变体数量少、工作量较小；区段操作是在熟知启动子上转录因子结合基序的前提下，对启动子区段进行删除、替换、多拷贝的顺式作用原件插入，主要也是改变启动子中受转录因子影响的位点。其余3种方法则是通过突变构建一个启动子突变体库，通过报告基因的表达从库里筛选转录活性提高的启动子，一般工作量大于定点突变法。常使用的报告基因包括常β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)、绿色荧光蛋白基因 (GFP)^[9]、红色荧光蛋白基因 (DsRed) 和葡萄糖醛酸酶基因 (GUS)^[10]等。以下介绍几种基因工程改造启动子的方法。

定点突变在启动子改造中是常用的方法。常见的一种定点突变方法是通过对启动子上的转录抑制因子结合位点进行突变，破坏这类位点，从而提高启动子的转录效率。采用此类方法，必须对启动子关键转录因子的结合位点有深入了解。里氏木霉中，cbh1启动子作为诱导型的启动子，受到葡萄糖碳源的抑制作用。在cbh1启动子的-700 bp到-1000 bp区域存在和葡萄糖抑制相关的广域调节的转录抑制因子Cre1的结合位点^[11]。唐偲洋等^[6]采用定点突变法对里氏木霉cbh1启动子进行改造，通过对4个Cre1结合位点 (5′-SYGGRG-3′) 依次进行定点突变，以红色荧光蛋白作为报告基因，发现4次突变对启动子强度都有一定的提高：第一处突变对启动子活性影响最为显著，几乎提高整个启动子21.19%的表达能力，而其余3处突变对启动子的活性也有一定提高。Zou等^[12]则将cbh1启动子-690、-698、-724^[13]3处Cre1结合位点分别突变成Hap2、Hap2和Ace2等转录激活因子的结合位点，绿色荧光蛋白在改造后的启动子驱动下，在诱导培养基中的表达量提高5.5倍；将改造的启动子用于驱动cbh1和eg11的表达，酶活力有很大提高。定点突变法能快速有效的得到优良的启动子，但是有时进行一个或少数几个位点的单点或组合突变并不能对启动子性能有所提升，还需要进行多次突变评估。

早在1994年，Verdoes等^[14]就在黑曲霉中引入多个拷贝的glaA启动子试图提高β-葡糖醛酸酶编码基因 (uidA) 的表达。虽然在此研究中，uidA表达量有所降低，未达到预期增强表达的效果，但这为使用区段法改造启动子开创了道路并具有一定的借鉴意义^[14]。同定点突变法类似，对启动子区段进行删除、替换、多拷贝的顺式作用原件插入，主要也是改变启动子中受转录因子影响的位点。通常，采用引入转录激活因子^[15]的结合位点或者删除抑制因子^[16]的结合位点来达到提高下游基因转录水平。Minetoki等^[17]采用插入多拷贝顺式作用元件的方式对米曲霉agdA启动子进行改造：米曲霉agdA启动子含有3个高度保守的序列，称为区段Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，区段Ⅲ能显著增加报告基因的表达，增加agdA启动子中Ⅲ区的拷贝数，外源基因的转录活性得到明显提高。Liu等^[18]在黑曲霉glaA启动子的顺式调节区段引入多拷贝的转录激活蛋白的结合基序CCAAT，将该改造后的启动子插入到表达质粒中大大增强外源蛋白质的表达，表明引入含CCAAT的序列增加启动子活性，可改善曲霉中异源和内源基因的表达。另外，还对里氏木霉cbh1启动子的区段采取删除及多拷贝的顺式作用原件插入相结合的方式进行改造。据了解，cbh1启动子的-1301到-869及-677到-724两处区段含有4个潜在的葡萄糖阻遏位点^{[12, 19]}。Liu等^[20-21]采用重组PCR法删除这两处区段，并将此启动子构建成以gus基因作为报告基因的质粒ΔpC。由于ΔpC cbh1启动子的-820到-620区段含有CCAAT盒 (Hap2的结合位点) 及Ace2等转录激活因子的结合位点，作者又构建分别含该功能区2, 4, 6拷贝序列的质粒Δp2C、Δp4C和Δp6C，然后将这些质粒分别转化里氏木霉，并进行GUS比活测定，结果显示改造后的启动子解除了葡萄糖阻遏效应，且ΔpC启动子是全长cbh1启动子强度的1.8倍。在此基础上的多拷贝启动子转化结果表明，随着启动子拷贝数的升高，报告基因的表达水平呈上升趋势，且Δp2C启动子是全长cbh1启动子强度的2.1倍，Δp4C启动子是全长cbh1启动子强度的2.4倍，但当拷贝数增加到6时，报告基因的表达水平与4拷贝转化子持平^[21]。采用理性设计进行区段操作的方式可以提高丝状真菌异源基因的表达效率，也为丝状真菌的遗传改造和分子育种提供了一条新的行之有效的途径。

对启动子的关键区段进行操作，是启动子改造的有效方式。和定点突变改造启动子类似，这也有赖于对启动子调控下游基因转录的顺式、反式元件分子机理的高度明晰。

随机突变的方法需要较大的突变库容量。由于丝状真菌的转化效率远远低于大肠杆菌和低等真菌 (如酿酒酵母)，所以应用随机突变的方法对丝状真菌的启动子改造的案例较少。但随着技术的进步，丝状真菌的转化效率可能会获得较大提升。因此，作为一种有重要应用前景的方法，本综述中也列入此部分研究进展。易错PCR^[22]、DNA shuffling^[23]和使用核苷酸类似物突变的^[24]方法都属于随机突变的方式。在不了解启动子调控机制的前提下，使用随机突变法可以获得较好的改造效果。易错PCR是使用保真率较低的Taq酶对启动子基因进行聚合酶链反应扩增，该法可得到随机突变的启动子DNA库。DNA shuffling是获得随机断裂的DNA片段并进行重组，然后产生大量新的启动子序列。在启动子改造中，应用DNA shuffling的方法获得的突变体库容量较高，得到活性增强的启动子的概率也较高。最近核苷酸类似物也被应用于启动子改造：该法在PCR反应中引入核苷酸类似物，可以引起很高的突变率，从而产生不同强度的启动子。Du等^[25]对代谢途径中多个基因中不同的启动子采用核苷酸类似物进行突变，通过绿色荧光蛋白筛选获得10种强度不同的启动子，在代谢途径中这些不同强度的启动子组合能够实现代谢途径的合理优化。如果将能此法应用在木糖和纤维二糖代谢途径中，则可提高代谢通路的效率，对工业生产效益最大化具有重要意义。

启动子作为转录调控的中心，一直是研究的热点，对启动子改造的研究已经快速和深入的发展^[26]。通过定点突变和区段操作改造启动子的方法已经相当成熟。在今后的丝状真菌启动子改造研究中，需要考虑使用引入随机突变的方法，而这高度依赖于转化效率的提高。另外，在丝状真菌的基因工程改造中，对反式作用因子进行改造也是需要值得注意^[27]，有报道称过表达转录激活因子能够提高丝状真菌蛋白表达量^[28]。但需要关注的是，涉及调控丝状真菌的启动子，如cbh1和glaA启动子的转录因子，并不是专一性的只调控这些基因。例如，Cre1是一个全局性的调节因子，能够调节很多代谢过程。所以在对这些关键因子进行操作时可能会对宿主产生生理和形态等影响。因此，常常需要进行多步改造才能使丝状真菌达到应用的要求。